一种CK-MB抗体及其制备方法、CK-MB检测试剂盒技术

本发明专利技术提供了一种CK

【技术实现步骤摘要】
一种CK
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MB抗体及其制备方法、CK
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MB检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及基因工程
，具体而言，涉及一种CK
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MB抗体及其制备方法、CK
‑
MB检测试剂盒。

技术介绍

[0002]肌酸激酶同工酶(CK
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MB)，是心肌细胞中特有的肌酸激酶，为肌酸激酶的亚型，只存在于心肌细胞中，其他组织器官中不存在，是心肌损伤的特异性标志物，因此在临床上，血清中CK
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MB水平的定量化检测可以辅助诊断心肌损伤。目前，采用CK
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MB检测试剂盒能够在体外对人血清或血浆中CK
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MB进行定量分析，而CK
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MB检测试剂盒中作为原料的CK
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MB抗体的稳定性直接影响试剂的产品性能。
[0003]存在的问题是：现有CK
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MB抗体的稳定性不佳。

技术实现思路

[0004]本专利技术解决了现有CK
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MB抗体的稳定性不佳的技术问题，实现了提高CK
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MB抗体的稳定性的技术效果。
[0005]为解决上述问题，本专利技术提供一种CK
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MB抗体的制备方法，包括以下步骤：S10：获得原始CK
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MB抗体，对原始CK
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MB抗体重链的FC片段氨基酸序列进行定点突变，获得改造后的氨基酸序列一；S20：优化氨基酸序列一，合成优化后的氨基酸序列一，获得氨基酸序列二；S30：构建重组表达载体：将氨基酸序列二插入质粒，获得重组表达载体；S40：抗体的重组表达：将重组表达载体转染至哺乳动物表达细胞中进行瞬时表达，纯化，得到CK
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MB抗体。
[0006]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：重组蛋白在生产、运输、储存等过程中，容易产生聚体和发生多种降解。其中蛋白质聚集可能对抗体的质量和功效有显著的负面影响，抗体聚集可能会减弱蛋白生物活性。因此，对原来的CK
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MB抗体进行改造，以减少聚集体的产生，进而提高CK
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MB抗体的稳定性。具体的，抗体FC片段是抗体的恒定区，在这个恒定区域内氨基酸的序列在不同的抗体中呈现相同的状态，抗体的不同类型，由抗体FC片段的特异性结构来进一步决定。将原来的CK
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MB抗体重链的FC片段氨基酸序列进行定点突变，其可以通过蛋白序列数据库多序列比对实现，找到容易产生聚集的氨基酸进行合理的定点突变，再将改造后的序列进行合成，构建质粒，转染后进行顺转表达，最终纯化得到的CK
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MB抗体具有更好的稳定性。
[0007]在本专利技术的一个实例中，对原始CK
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MB抗体重链的FC片段氨基酸序列进行定点突变，包括以下步骤：S11：将原始CK
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MB抗体重链FC片段的第74位P氨基酸替换为T氨基酸，第75位R氨基酸替换为W氨基酸，第276位N氨基酸替换为D氨基酸，第278位N氨基酸替换为D氨基酸。
[0008]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过对上述原始CK
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MB抗体重链FC片段的氨基酸位点进行定点突变，能够减少聚集体的产生，进而提高CK
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MB抗体的稳定性。
[0009]在本专利技术的一个实例中，优化氨基酸序列一，包括以下步骤：S21：对氨基酸序列一进行抗体可变区分析，将高聚集倾向区域中的部分氨基酸进行定点突变。
[0010]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：免疫球蛋白轻链和重链靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区。可变区内包含互补决定区CDR区与FR骨架区，根据Kabat法能够确定序列CDR区和FR区，其中，CDR区决定抗体的特异性，是Ig的抗原结合部位。蛋白质的一级结构及疏水氨基酸的相对数目对蛋白质的聚集速率和聚集体的稳定性有较大的影响。疏水氨基酸会形成聚集倾向区域，在特定位置引入一个新的或不同的疏水氨基酸会显著加快蛋白聚集速率。因此，通过改造疏水氨基酸，对其特定位置进行定点突变，能够减慢蛋白聚集速率，进而减少聚集体的产生。
[0011]在本专利技术的一个实例中，将高聚集倾向区域中的部分氨基酸进行定点突变，包括以下步骤：S22：将原始CK
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MB抗体原轻链的第54位L氨基酸替换为R氨基酸，第74位的T氨基酸替换为S氨基酸，第76位的T氨基酸替换为N氨基酸，第85位的V氨基酸替换为T氨基酸。
[0012]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：通过对上述氨基酸位点进行定点突变，能够显著减慢蛋白聚集速率，减少聚集体的产生，进而提高CK
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MB抗体的稳定性。
[0013]在本专利技术的一个实例中，将高聚集倾向区域中的部分氨基酸进行定点突变，还包括以下步骤：S23：将原始CK
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MB抗体原重链的第20位I氨基酸替换为L氨基酸，第79位V氨基酸替换为A氨基酸，第95位I氨基酸替换为Y氨基酸，第111位的L氨基酸替换为S氨基酸。
[0014]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：I、V和L氨基酸存在的序列是最容易发生疏水性聚集的基序，经蛋白质自聚集软件分析发现热点部位经常含有I、V、L氨基酸，因此将其定点突变可以减少聚集体的产生，进而提高CK
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MB抗体的稳定性。
[0015]在本专利技术的一个实例中，哺乳动物表达细胞为CHO细胞。
[0016]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：CHO细胞具有以下优点：CHO细胞具有和人类相似的翻译后修饰，对蛋白有准确的加工、修饰功能，表达的蛋白质的生物学活性更接近天然蛋白；CHO细胞属于成纤维细胞，是一种非分泌型细胞，它本身很少分泌CHO内源蛋白，因此对目标蛋白分离纯化工作十分有利；CHO细胞易于培养，既可贴壁生长也可以进行悬浮培养，且耐受剪切力和渗透压的能力相对较强，在无血清及化学限定培养基中能够快速稳健地悬浮生长；CHO细胞整合外源基因后细胞稳定，重组基因能够高效扩增和表达，进而通过上述制备方法所得到的CK
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MB抗体的表达量高。
[0017]在本专利技术的一个实例中，纯化采用Protein G层析纯化。
[0018]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：protein G可以和抗体IgG分子的Fc段特异性结合，通过亲和层析法分离出的CK
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MB抗体纯度较高，且纯化步骤少，纯化时间短。
[0019]在本专利技术的一个实例中，制备方法还包括：S50：采用Elisa法检测CK
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MB抗体的活性。
[0020]与现有技术相比，采用该技术方案所达到的技术效果：ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种CK
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MB抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S10：获得原始CK
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MB抗体，对所述原始CK
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MB抗体重链的FC片段氨基酸序列进行定点突变，获得改造后的氨基酸序列一；S20：优化所述氨基酸序列一，合成优化后的所述氨基酸序列一，获得氨基酸序列二；S30：构建重组表达载体：将所述氨基酸序列二插入质粒，获得所述重组表达载体；S40：抗体的重组表达：将所述重组表达载体转染至哺乳动物表达细胞中进行瞬时表达，纯化，得到所述CK
‑
MB抗体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述对所述原始CK
‑
MB抗体重链的FC片段氨基酸序列进行定点突变，包括以下步骤：S11：将所述原始CK
‑
MB抗体重链FC片段的第74位P氨基酸替换为T氨基酸，第75位R氨基酸替换为W氨基酸，第276位N氨基酸替换为D氨基酸，第278位N氨基酸替换为D氨基酸。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述优化所述氨基酸序列一，包括以下步骤：S21：对所述氨基酸序列一进行抗体可变区分析，将高聚集倾向区域中的部分氨基酸进行定点突变。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述将高聚集倾向区域中的部分氨基酸进行定点突变，包括以下步骤：S22...

【专利技术属性】
技术研发人员：邹炳德，宋丹丽，唐云霞，宋张晴，丁建静，袁姗姗，
申请(专利权)人：美康生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：