中和TaqDNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术提出了中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用，该抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12，所述抗体可特异性作用于Taq DNA聚合酶或其突变体，从而显著减少PCR过程中引物、探针或模板的降解，及模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。显著提高PCR的反应效率。

【技术实现步骤摘要】
中和Taq DNA聚合酶聚合活性的单克隆抗体及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体地，本专利技术涉及特异性中和Taq DNA聚合酶聚合活性的抗体及其应用，更具体地，本专利技术涉及一种抗体或抗原结合片段、抗体的用途、抗体的制备方法、热启动Taq DNA 聚合酶、热启动Taq DNA聚合酶的用途、热启动Taq DNA聚合酶的制备方法以及一种药物组合物、一种试剂盒。

技术介绍

[0002]Taq DNA聚合酶参与的PCR技术广泛应用于生化试验和体外诊断行业中。Taq酶是从水生栖热菌Thermus Aquaticus中分离出的具有热稳定性的DNA聚合酶，是一种高温酶，该酶在常温下仍具有一定的活性。因此，在PCR预变性前，Taq DNA聚合酶5
’‑3’
外切活性能够引起引物、探针或模板的降解，而其聚合活性在PCR预变性前阶段可引起模板或引物错配而产生非特异性的扩增；在后续PCR循环过程中非特异性产物被进一步放大，造成目的产物产量降低，甚至扩增不出来目的条带。热启动的方法可以有效地解决上述问题，即在PCR预变性前阶段可逆地使Taq DNA聚合酶失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq DNA聚合酶活性，使其恢复活性。
[0003]目前常用的热启动方法有抗体法、化学修饰法、适体法等。其中化学修饰法较为常用，活性封闭较为完全、不会引入外源污染，但是其活性较难完全激活，需要高温孵育较长时间。而适体法活性又较难彻底封闭，温度往往升高到45℃以上即可恢复活性，很难达到严格的热启动。和上述两种方法相比，抗体法具有一定的优势：Taq DNA聚合酶抗体能够在常温下完全抑制Taq DNA聚合酶活性，随着温度的升高，活性在60℃以上才慢慢释放，95℃热激3
‑
5分钟，可完全释放Taq酶活性。
[0004]一步法RT
‑
qPCR是目前最常用的分子诊断检测方法，而热启动Taq DNA聚合酶是一步法RT
‑
qPCR 反应的核心酶。因此，研发具有中和Taq DNA聚合酶聚合活性的抗体，具有巨大的应用空间和市场前景。

技术实现思路

[0005]本申请是基于专利技术人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
[0006]Taq DNA聚合酶是一种在分子诊断领域广泛应用的酶，热启动Taq DNA聚合酶是指该聚合酶在低温下活性被抑制，随着温度的升高，在预变性阶段Taq酶活性被完全释放。该方法能够有效地降低PCR 预变性前非特异性扩增的产生，提高PCR/RT
‑
PCR反应的灵敏度及产量。专利技术人采用Taq DNA聚合酶聚合活性区域(即KlenTaq DNA聚合酶)免疫小鼠制备杂交瘤细胞，通过筛选获得能够中和Taq酶聚合活性的抗体，惊喜的发现该抗体可在PCR预变性前阶段可逆地使Taq DNA聚合酶失去活性，在PCR 预变性阶段激活Taq DNA聚合酶活性，使其恢复活性，该抗体可应用于一步法RT
‑
qPCR反应，并具有显著的优势。
[0007]为此，在本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：
NO:13)。
[0025]EVQLQQSGAELVKPGASVKLSCKASTYTFNNYWMHWVKQWPGQGLEWIGEINPSIGRTIYNEKF KTQATLTVDKSKSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCVRGPNVFVTSHDFAFDGWGQGTSVTVSSAKTTPPSD YPLA(SEQ ID NO:14)。
[0026]根据本专利技术的实施例，所述抗体具有如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链可变区，或者与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。根据本专利技术的实施例，含有所述轻链可变区的所述抗体可使得Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体在PCR预变性前阶段可逆地失去活性，在PCR预变性阶段激活Taq酶活性，从而降低引物、探针或模板的降解，降低PCR过程中模板或引物错配而产生的非特异性扩增，显著提高PCR的反应效率。
[0027]IVITQTPKFLLVSAGDRVTMTCKASQSVNNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSG FGTDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSSPYTFGGGTKLEIRRADAAPTVS(SEQ ID NO:15)。
[0028]IVMTQAPKFLLVSAGDRVTMTCKASSSVSNDVAWYQQKPGQSPKLLIYYASNRYTGVPDRFTGSL FGDDFTFTISTVQAEDLAVYFCQQDYSVSYSFGGGTKLEIRRADAAPTVS(SEQ ID NO:16)。
[0029]根据本专利技术的实施例，所述抗体可结合Taq DNA聚合酶或其突变体。根据本专利技术的实施例，所述抗体于48～55℃温度下可特异性抑制96％～99％Taq DNA聚合酶或其突变体的聚合活性。
[0030]根据本专利技术的实施例，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:17。
[0031]MRGMLPLFEPKGRVLLVDGHHLAYRTFHALKGLTTSRGEPVQAVYGFAKSLLKALKEDGDAVIVV FDAKAPSFRHEAYGGYKAGRAPTPEDFPRQLALIKELVDLLGLARLEVPGYEADDVLASLAKKAEKEG YEVRILTADKDLYQLLSDRIHVLHPEGYLITPAWLWEKYGLRPDQWADYRALTGDESDNLPGVKGIGE KTARKLLEEWGSLEALLKNLDRLKPAIREKILAHMDDLKLSWDLAKVRTDLPLEVDFAKRREPDRERL RAFLERLEFGSLLHEFGLLESPKALEEAPWPPPEGAFVGFVLSRKEPMWADLLALAAARGGRVHRAPE PYKALRDLKEARGLLAKDLSVLALREGLGLPPGDDPMLLAYLLDPSNTTPEGVARRYGGEWTEEAGE RAALSERLFANLWGRLEGEERLLWLYREVERPLSAVLAHMEATGVRLDVAYLRALSLEVAEEIARLEAE VFRLAGHPFNLNSRDQLERVLFDELGLPAIGKTEKTGKRSTSAAVLEALREAHPIVEKILQYRELTKLKS TYIDPLPDLIHPRTGRLHTRFNQTATATGRLSSSDPNLQNIPVRTPLGQRIRRAFIAEEGWLLVALDYSQIE LRVLAHLSGDENLIRVFQEGRDIHTETASWMFGVPREAVDPLMRRAAKTINFGVLYGMSAHRLS本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有选自下列至少之一的CDR序列或与其具有至少95％同一性的氨基酸序列：重链可变区CDR序列：SEQ ID NO:1～6，轻链可变区CDR序列：SEQ ID NO:7～12。2.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:1、2和3或者与SEQ ID NO:1、2和3具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:4、5和6或者与SEQ ID NO:4、5和6具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的重链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。3.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体包括：分别如SEQ ID NO:7、8和9或者与SEQ ID NO:7、8和9具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列；或者分别如SEQ ID NO:10、11和12或者与SEQ ID NO:10、11和12具有至少95％同一性的氨基酸序列所示的轻链可变区CDR1、CDR2、CDR3序列。4.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体含有如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示氨基酸序列的重链可变区，或者与SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的抗体或抗原结合片段，其特征在于，所述抗体具有如SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示氨基酸序列的轻链可变区，或者与SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％同一性的氨基酸序列。6.根据权利要求1～5任一项所述的抗体，其特征在于，所述抗体结合Taq DNA聚合酶或其突变体；任选地，所述Taq DNA聚合酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:17；任选地，所述Taq DNA聚合酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:18。7.一种DNA聚合酶组合物，其特征在于，包括：权利要求1～6任一项所述的抗体和Taq DNA聚合酶或其突变体；任选地，所述抗体与所述Taq DNA聚合酶或Taq DNA聚合酶突变体的质量比为1：1～4：1。8.一种试剂盒，其特征在于，包含权利要求7所述的DNA聚合酶组合物。9.一种PCR方法，其特征在于，将权利要求7所述的DNA聚合酶组合物与DNA模板进行混合；将所述混合液进行PCR反应，以便扩增所述DNA模板。10.一种制备抗体的方法，所述抗体用于结合Taq DNA聚合酶或其突变体，其特征在于，包括以下步骤：1)将脾脏细胞与骨髓瘤细胞进行混合处理，以便获得杂交瘤细胞，所述脾脏细胞与骨髓瘤细胞来源于经过Taq DNA聚合酶免疫的小鼠；2)对所述杂交瘤细胞进行第一筛选处理，以获得阳性克隆；
3)对所述阳性克隆进行有限稀释处理，以便获得单克隆株，在预定培养孔中只含有一株所述单克隆株；4)对所述单克隆株进行第二筛选处理，以便获得优势亚克隆杂交瘤细胞株；5)获得所述优势亚克隆杂交瘤细胞株培养液的上清液，所述上清液中含有目标抗体；任选地，进一步包括对所述上清液进行纯化处理；任选地，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：高重亮，陈茁，周娇娇，谢庆庆，郑越，董宇亮，章文蔚，
申请(专利权)人：深圳华大生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：