一种噬菌体凝胶及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开一种噬菌体凝胶，包括噬菌体颗粒、耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖和固化剂，其中，所述耐高温材料为明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、F

【技术实现步骤摘要】
一种噬菌体凝胶及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物药物或者饲料添加剂
，具体地涉及一种噬菌体凝胶及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]随着抗生素的广泛应用甚至滥用，耐药菌株(包括多耐药菌株)频现，抗生素治疗效果受到严峻的挑战。而且，2020年7月1日起，我国全面禁止在饲料端添加促生长类抗生素，养殖端“限抗、减抗”，全球的最终目标，“2027年实现畜禽类绝对的无抗养殖”，因此，开发新型抗菌产品成为迫在眉睫的社会需求。噬菌体是一种“吃”细菌的纳米级微生物，在自然界广泛存在，其不仅是耐药菌，甚至是多重耐药菌的克星。与抗生素相比，噬菌体的杀菌速度快、专一性强、不影响动物肠道正常菌群以及其抗菌效果不受细菌耐药性的限制等优势，是最有潜力的抗生素替代品。但是噬菌体作为一种具有生物活性的微生物，在制剂生产、产品保存、使用及运输过程中容易死亡失活且水剂运输不便，而且口服噬菌体在动物体内消化时易被胃酸、蛋白酶破坏，极易随体液和粪便排出体外，难以发挥有效肠道抗菌及调节肠道微生态的功能，因此，保护和稳定噬菌体便成为临床应用亟待解决的问题，而噬菌体凝胶包封则是目前最有希望的解决途径。
[0003]治疗性噬菌体的凝胶配方通过延长其保质期、提高其易操作性并最终保持其长期效力来改善其“可药物性”是有吸引力的。赋形剂的使用和选择对于稳定固体制剂中的噬菌体和保护其生存能力免受固化过程中遇到的应力以及在固化前的长期储存至关重要使用。解决这些挑战为噬菌体制剂的重新设计和重新构思提供了新的机会，以提高其作为生物医药产品的功效。

技术实现思路

[0004]专利技术目的：针对现有技术中存在的技术问题，本专利技术提出一种噬菌体凝胶，以多种裂解性噬菌体为主要成分，通过耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖及固化剂等将噬菌体有效包裹起来，制备成噬菌体凝胶，维持噬菌体良好的耐热稳定性，减少噬菌体在加工、储存和运输过程中的效价损失，同时保护噬菌体有效抵御动物消化道中的胃酸和消化酶的破坏，保证噬菌体靶向动物肠道，延长作用时间，提高稳定性和裂解活性。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题在于提出上述噬菌体凝胶的制备方法和应用。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提出了一种噬菌体凝胶，包括噬菌体颗粒、耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖和固化剂，其中，所述耐高温材料为明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、F
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68中的任意一种或者几种的组合；所述耐胃酸材料为羧甲基纤维素钠、壳聚糖、碳酸钙中的任意两种或者多种的组合。
[0007]其中，噬菌体颗粒、耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖和固化剂的质量比为：70～90％：2～8％：2～8％：2～8％：1～2％。
[0008]所述阴离子多糖为海藻酸钠、卡拉胶中的任意一种或者两种的组合。
[0009]所述固化剂为氯化钙溶液中的钙离子。
[0010]所述的噬菌体凝胶还包括成膜剂，所述成膜剂为醋酸改性壳聚糖。优选地，所述醋酸改性壳聚糖的浓度为0.2～1.0wt％(wt/vol，g/mL)。
[0011]所述噬菌体颗粒包含裂解型噬菌体，包括但不限于大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、肺炎克雷伯噬菌体中的任意一种或者多种，其活噬菌体效价为108～10
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PFU/g。
[0012]具体地，所述噬菌体颗粒包括产肠毒素性大肠杆菌K88噬菌体，保藏号为CTCC NO:M 209243；大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_C1，保藏号为CTCC NO:M2017190；沙门氏菌噬菌体PSA
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6，保藏号为CCTCC NO:M 2010226；鸡白痢沙门氏菌噬菌体PSPu
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116，保藏号为CCTCC NO:M2011042；肠炎沙门氏菌噬菌体JN54KDE，保藏号为CCTCC NO:M2014429；鼠伤寒沙门氏菌噬菌体JX178，保藏号为CCTCC NO:M2014433；德尔卑沙门氏菌噬菌体JX067
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2，保藏号为CCTCC NO:M2014431；伦敦沙门氏菌噬菌体JSD9，保藏号为CCTCC NO:M2014432；肺炎克雷伯氏菌vB_KpnM_he1，保藏号为CCTCC NO:M2015760。上述菌种可以根据具体的致病菌进行选择。
[0013]本专利技术进一步提出了上述噬菌体凝胶的制备方法，包括如下步骤：
[0014](1)对于每一种噬菌体，经扩增培养后，离心获得粗噬菌体裂解液，然后采用膜分离技术，去除培养基、细菌毒素和碎片，再经水系滤膜过滤，得到精纯噬菌体颗粒，优选地，用100～150kDa膜分离去除培养基、细菌毒素和碎片，然后经0.22μm的水系滤膜过滤，得到精纯噬菌体溶液，然后过滤除菌后检测效价并确认无污染后；
[0015](2)将步骤(1)制备的噬菌体溶液，与2～8wt％的耐高温材料、2～8wt％的阴离子多糖溶液、2～8wt％的碳酸钙溶液按照体积比为2～4:1～2:1～2:1～2比例混匀，得到混合溶液；
[0016](3)将步骤(2)制备的混合液滴入固化剂中，搅拌固化制备成微液滴，形成噬菌体凝胶；优选地，以5～10mL/min的滴速滴入固化剂中，在300～600rpm下搅拌固化15～30min得到噬菌体凝胶；
[0017](4)将步骤(3)制备的噬菌体凝胶转移到醋酸改性壳聚糖溶液中15～30min，成膜并保护噬菌体凝胶，优选地，所述醋酸改性壳聚糖溶液浓度为0.2～1.0％(wt/vol，g/ml)，具体地，所述醋酸改性壳聚糖溶液通过如下方法制备得到：首先配制浓度为1％的醋酸100mL，然后，加入0.2～1.0g壳聚糖，磁力搅拌10h～24h，使其完全溶解即得。
[0018]本专利技术还提出了上述噬菌体凝胶作为畜禽的饲料添加剂的应用。优选地，所述畜禽为猪、鸡、牛、羊、鸭、鹅。
[0019]其中，所述噬菌体凝胶提高饲料清除动物肠道病原菌的能力。
[0020]利用本专利技术方法制备得到的噬菌体凝胶，噬菌体可以耐受饲料制粒过程中的90℃高温破坏5min，可耐受超低胃酸(pH 1.2)，无破损且噬菌体活性稳定，同时肠道内缓释时间长达5天，有效抑制病原菌生长，且噬菌体凝胶结构有效保护噬菌体活性，提高噬菌体保存稳定性，常温储存期6个月以上。
[0021]有益效果：与现有技术相比，本专利技术制备得到的噬菌体凝胶可以耐受饲料制粒过程中的高温破坏，保持高活性和稳定性(90℃5min)，且可以耐受胃酸及胃蛋白酶侵蚀，仍保持稳定性和活性(耐胃酸，pH 1.2)，同时噬菌体可以顺利通过胃液到达肠道，在肠道内释放时间长达6天，有效抑制肠道病原菌生长，保证肠道健康，另外，本专利技术的噬菌体凝胶结构有效保护噬菌体活性，提高噬菌体保存稳定性，常温储存期6个月以上，所用包封材料均为天
然高分子纳米材料，不添加任何表面活性剂或者有机试剂，无毒绿色型、无刺激性气味、无环境污染问题、生物可降解、来源广、价格便宜，适合作为畜禽的饲料添加剂，尤其可以用于饲料制粒，有效清除动物肠道病原菌。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种噬菌体凝胶，其特征在于，包括噬菌体颗粒、耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖和固化剂，其中，所述耐高温材料为明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、F
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68中的任意一种或者几种的组合；所述耐胃酸材料为羧甲基纤维素钠、壳聚糖、碳酸钙中的任意两种或者多种的组合。2.根据权利要求1所述的噬菌体凝胶，其特征在于，噬菌体颗粒、耐高温材料、耐胃酸材料、阴离子多糖和固化剂的质量用量比为：70~90%：2~8%：2~8%：2~8%：1~2%。3.根据权利要求1所述的噬菌体凝胶，其特征在于，所述阴离子多糖为海藻酸钠、卡拉胶中的任意一种或两者的组合。4.根据权利要求1所述的噬菌体凝胶，其特征在于，所述固化剂为氯化钙溶液中的钙离子。5.根据权利要求1所述的噬菌体凝胶，其特征在于，所述噬菌体凝胶还包括成膜剂，所述成膜剂为醋酸改性壳聚糖溶液。6.根据权利要求1所述的噬菌体凝胶，其特征在于，所述噬菌体颗粒包含大肠杆菌噬菌体、沙门氏菌噬菌体、肺炎克雷伯噬菌体中的任意一种或者多种，其活噬菌体效价为108~10
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【专利技术属性】
技术研发人员：包红朵，王冉，张辉，周艳，朱树娇，仲召鑫，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：