一种MSC-exo促进巧囊纤维化机制的研究方法技术

本发明专利技术提供了一种MSC

【技术实现步骤摘要】
一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法


[0001]本专利技术涉及子宫内膜异位症研究
，特别地涉及了一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法。

技术介绍

[0002]子宫内膜异位症（endometriosis，EMT，简称内异症）的异位内膜侵犯卵巢皮质并在其内生长、反复周期性出血，形成单个或多个囊肿型典型病变，即卵巢子宫内膜异位囊肿，因囊液似巧克力液，又称卵巢巧克力囊肿，简称巧囊。巧囊纤维化是造成手术难于剥离、易丢失部分正常卵巢组织的主要原因，探寻其纤维化形成机制及作用靶点，对临床诊疗有积极的指导意义。
[0003]外泌体（exosome）是间充质干细胞（MSC）旁分泌作用的主要物质，异位子宫内膜间充质干细胞来源外泌体（MSC
‑
exo）可促进EMT发生发展，但其在巧囊纤维化中的作用尚未明确。Yes相关蛋白
‑
1（YAP1）、转录共激活因子PDZ结合基序（TAZ）是经典Hippo通路的主要效应分子，YAP1/TAZ可调节成纤维活化与基质形成，从而介导组织器官纤维化。MSC
‑
exo促进巧囊纤维化的分子机制可能与调控YAP1/TAZ通路有关。
[0004]基于此，本专利技术设计了一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法，以解决上述提到的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法，以解决上述
技术介绍
中提出的技术问题。
[0006]本专利技术的技术方案为：一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法，所述研究方法包括阶段一和阶段二：阶段一为检测卵巢异位子宫内膜间质细胞和正常子宫内膜间质细胞中YAP1和TAZ的含量变化，分析YAP1和TAZ对巧囊纤维化的影响；阶段二为分析异位子宫内膜MSC
‑
exo通过调控YAP1/TAZ通路对子宫内膜间质细胞纤维化的影响。
[0007]作为更进一步的优选方案，阶段一具体包括以下步骤：S11、采集人卵巢异位子宫内膜组织与正常子宫内膜组织，通过PCR及免疫组化法检测组织中YAP1和TAZ的表达差异；S12、分离培养原代卵巢异位内膜间质细胞与原代正常子宫内膜间质细胞，检测细胞的增殖活性、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭能力、纤维化相关指标以及YAP1/TAZ通路活化情况；S13、构建内异症大鼠模型，观察大鼠异位病灶组织的病理学变化，通过Sirius
‑
red染色和Masson染色观察病灶纤维化程度，通过PCR和western blot法检测纤维化相关指标以及YAP1/TAZ通路活化情况。
[0008]作为更进一步的优选方案，所述步骤S11的具体步骤如下：S111、样本采集，收集巢异位子宫内膜标本和正常子宫内膜标本；S112、YAP1和TAZ检测，利用PCR和免疫组化法检测卵巢异位子宫内膜组织与正常子宫内膜组织中YAP1和TAZ表达水平的差异；S113、数据分析，分析YAP1和TAZ在不同类型组织中表达水平的差异与子宫内膜异位症病理特征的关系。
[0009]作为更进一步的优选方案，所述步骤S12的具体步骤如下：S121、细胞培养，从卵巢异位子宫内膜组织与正常子宫内膜组织中分别分离出原代卵巢子宫异位内膜间质细胞和原代正常子宫内膜间质细胞，对细胞进行培养；S122、实验分组，按照以下条件将步骤S121培养好的原代卵巢子宫异位内膜间质细胞和原代正常子宫内膜间质细胞各分为五组实验：
①
正常对照组，仅给予PBS溶液培养子宫内膜间质细胞；
②
模型组，加入10ng/ml TGF
‑
β1培养子宫内膜间质细胞；
③
阴性对照组，加入TGF
‑
β1+空白质粒培养子宫内膜间质细胞；
④
YAP1过表达组，加入TGF
‑
β1+YAP1质粒至培养子宫内膜间质细胞；
⑤
YAP1沉默组，加入TGF
‑
β1+si
‑
YAP1质粒培养子宫内膜间质细胞；培养48h后用于后续的实验；S123、细胞增殖检测，利用CCK8法检测不同时间点下实验组的细胞增殖活性；S124、细胞凋亡检测，利用凋亡试剂盒对每组实验进行处理；S125、细胞迁移检测，利用划痕实验检测每组实验的细胞迁移能力；S126、细胞侵袭检测，利用Transwell实验检测每组实验的细胞侵袭能力；S127、纤维化指标检测，利用PCR和western blot法检测每组实验的纤维化相关指标，所述纤维化相关指标包括α
‑
SMA、Col
‑
I、Col
‑
III和FN；S128、YAP1/TAZ检测，利用PCR和western blot法检测每组实验的YAP1/TAZ表达情况。
[0010]作为更进一步的优选方案，步骤S13的具体步骤如下：S131、建立动物模型，选取饲养程度大致相同的SD大鼠，采用同种异体子宫内膜移植法对SD大鼠进行处理，得到大鼠模型；S132、实验分组，将步骤S131中建立的子宫内膜异位症模型分为五组实验：
①
正常对照组，只进行术部切开的子宫内膜异位症模型，不做其他处理；
②
模型组，建立子宫内膜组织细胞的EMT模型；
③
阴性对照组，建立EMT模型并注射空白质粒至尾静脉；
④
YAP1过表达组，建立EMT模型并注射YAP1质粒至尾静脉；
⑤
YAP1沉默组，建立EMT模型并注射EMT+si
‑
YAP1至尾静脉；S133、组织病理学变化检测，利用HE染色对每组实验进行处理，观察异位病灶组织的病理学变化；S134、病灶纤维化检测，利用Sirius
‑
red染色和Masson染色对每组实验进行处理，观察病灶纤维化程度；S135、纤维化指标检测，利用PCR和免疫组化法检测每组实验的纤维化相关指标，所述纤维化相关指标包括α
‑
SMA、Col
‑
I、Col
‑
III和FN；S136、YAP1/TAZ通路检测，利用PCR和免疫组化法检测每组实验的YAP1和TAZ的表达情况。
[0011]作为更进一步的优选方案，阶段二具体包括以下步骤：S21、分离异位子宫内膜MSC，并用流式细胞术鉴定；分离浓缩MSC
‑
exo，并用流式细胞术鉴定；S22、分离并分组培养原代细胞，分组加入MSC
‑
exo，检测细胞的增殖活性、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭能力、纤维化相关指标以及YAP1/TAZ通路活化情况；S23、构建内异症大鼠模型，观察大鼠异位病灶组织的病理学变化，通过Sirius
‑
red染色和Masson染色观察病灶纤维化程度，通过PCR和weste本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法，其特征在于，所述研究方法包括阶段一和阶段二：阶段一为检测卵巢异位子宫内膜间质细胞和正常子宫内膜间质细胞中YAP1和TAZ的含量变化，分析YAP1和TAZ对巧囊纤维化的影响；阶段二为分析异位子宫内膜MSC
‑
exo通过调控YAP1/TAZ通路对子宫内膜间质细胞纤维化的影响。2.如权利要求1所述的一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法，其特征在于，阶段一具体包括以下步骤：S11、采集人卵巢异位子宫内膜组织与正常子宫内膜组织，通过PCR及免疫组化法检测组织中YAP1和TAZ的表达差异；S12、分离培养原代卵巢异位内膜间质细胞与原代正常子宫内膜间质细胞，检测细胞的增殖活性、细胞凋亡、细胞迁移及侵袭能力、纤维化相关指标以及YAP1/TAZ通路活化情况；S13、构建内异症大鼠模型，观察大鼠异位病灶组织的病理学变化，通过Sirius
‑
red染色和Masson染色观察病灶纤维化程度，通过PCR和western blot法检测纤维化相关指标以及YAP1/TAZ通路活化情况。3.如权利要求2所述的一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法，其特征在于，所述步骤S11的具体步骤如下：S111、样本采集，收集巢异位子宫内膜标本和正常子宫内膜标本；S112、YAP1和TAZ检测，利用PCR和免疫组化法检测卵巢异位子宫内膜组织与正常子宫内膜组织中YAP1和TAZ表达水平的差异；S113、数据分析，分析YAP1和TAZ在不同类型组织中表达水平的差异与子宫内膜异位症病理特征的关系。4.如权利要求2所述的一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法，其特征在于，所述步骤S12的具体步骤如下：S121、细胞培养，从卵巢异位子宫内膜组织与正常子宫内膜组织中分别分离出原代卵巢子宫异位内膜间质细胞和原代正常子宫内膜间质细胞，对细胞进行培养；S122、实验分组，按照以下条件将步骤S121培养好的原代卵巢子宫异位内膜间质细胞和原代正常子宫内膜间质细胞各分为五组实验：
①
正常对照组，仅给予PBS溶液培养子宫内膜间质细胞；
②
模型组，加入10ng/ml TGF
‑
β1培养子宫内膜间质细胞；
③
阴性对照组，加入TGF
‑
β1+空白质粒培养子宫内膜间质细胞；
④
YAP1过表达组，加入TGF
‑
β1+YAP1质粒至培养子宫内膜间质细胞；
⑤
YAP1沉默组，加入TGF
‑
β1+si
‑
YAP1质粒培养子宫内膜间质细胞；培养48h后用于后续的实验；S123、细胞增殖检测，利用CCK8法检测不同时间点下每组实验的细胞增殖活性；S124、细胞凋亡检测，利用凋亡试剂盒对每组实验进行处理；S125、细胞迁移检测，利用划痕实验检测每组实验的细胞迁移能力；S126、细胞侵袭检测，利用Transwell实验检测每组实验的细胞侵袭能力；S127、纤维化指标检测，利用PCR和western blot法检测每组实验的纤维化相关指标，所述纤维化相关指标包括α
‑
SMA、Col
‑
I、Col
‑
III和FN；S128、YAP1/TAZ检测，利用PCR和western blot法检测每组实验的YAP1/TAZ表达情况。
5.如权利要求2所述的一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化机制的研究方法，其特征在于，步骤S13的具体步骤如下：S131、建立动物模型，选取饲养程度大致相同的SD大鼠，采用同种异体子宫内膜移植法对SD大鼠进行处理，得到大鼠模型；S132、实验分组，将步骤S131中建立的子宫内膜异位症模型分为五组实验：
①
正常对照组，只进行术部切开的子宫内膜异位症模型，不做其他处理；
②
模型组，建立子宫内膜组织细胞的EMT模型；
③
阴性对照组，建立EMT模型并注射空白质粒至尾静脉；
④
YAP1过表达组，建立EMT模型并注射YAP1质粒至尾静脉；
⑤
YAP1沉默组，建立EMT模型并注射EMT+si
‑
YAP1至尾静脉；S133、组织病理学变化检测，利用HE染色对每组实验进行处理，观察异位病灶组织的病理学变化；S134、病灶纤维化检测，利用Sirius
‑
red染色和Masson染色对每组实验进行处理，观察病灶纤维化程度；S135、纤维化指标检测，利用PCR和免疫组化法检测每组实验的纤维化相关指标，所述纤维化相关指标包括α
‑
SMA、Col
‑
I、Col
‑
III和FN；S136、YAP1/TAZ通路检测，利用PCR和免疫组化法检测每组实验的YAP1和TAZ的表达情况。6.如权利要求1所述的一种MSC
‑
exo促进巧囊纤维化...

【专利技术属性】
技术研发人员：丰颖，谭布珍，陈琦，姚美珍，占伏良，
申请(专利权)人：南昌大学第二附属医院，
类型：发明
国别省市：