一种泛素偶联修饰的嵌合抗原受体及免疫细胞制造技术

本发明专利技术涉及医药领域，特别是涉及一种泛素偶联修饰的嵌合抗原受体及免疫细胞，所述泛素偶联至嵌合抗原受体的C端。本发明专利技术提供的简单易行且适用于不同靶点的高自激活水平嵌合抗原受体及免疫细胞具有应用简单、可重复性高、普适性好和优化程度高等优势，适用于各种现行的CAR

【技术实现步骤摘要】
一种泛素偶联修饰的嵌合抗原受体及免疫细胞


[0001]本专利技术涉及生物医药领域，特别是涉及一种泛素偶联修饰的嵌合抗原受体及免疫细胞。

技术介绍

[0002]嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是一种人工改造的靶向肿瘤的抗原受体。CAR
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T疗法是通过在患者自身T细胞上表达特异性识别抗原和传递T细胞信号的CAR，使其能在患者体内识别并杀伤肿瘤细胞的一种过继性免疫疗法。CAR组成主要包括：能够识别并结合特异性肿瘤抗原的单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，其特异性可以实现对肿瘤细胞的精确识别与“定点打击”；T细胞受体(T cell receptor,TCR)ζ链的胞内结构域，可以在scFv结构识别肿瘤抗原后，有效激活T细胞，而激活后的T细胞能够大量分泌细胞因子，在自身快速增殖的同时，有效杀伤肿瘤细胞，并通过分泌的炎症因子招募其他免疫细胞；在此基础上，在CAR胞内区域加入CD28或者41BB等共刺激分子的信号结构域，则可以增强CAR激活T细胞的能力，提升CAR
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T细胞在体内存活的能力。
[0003]目前，CAR
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T疗法已经在多种类型的肿瘤，尤其是针对血液类肿瘤的临床治疗中，取得了显著的成功。2017年，美国FDA先后批准上市了两款靶向CD19抗原的商业化CAR
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T治疗产品，用于治疗复发难治性恶性B细胞白血病及淋巴瘤，并取得了显著的疗效。然而，CAR/>‑
T疗法在应对实体瘤的治疗中仍然存在诸多局限性因素。2019年Robbie等人总结了当前CAR
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T疗法在临床应用过程中遇到的问题，并指出其中限制CAR
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T细胞在体内发挥功能的原因之一是由于肿瘤微环境、肿瘤靶标负担过大、T细胞本底自激活水平过高等因素导致的T细胞功能耗竭，从而无法有效杀伤肿瘤。大量研究表明，降低CAR对于T细胞自激活的影响，能够有效地缓解CAR
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T细胞在培养增殖过程中由于过度分化、提前耗竭等原因导致的CAR
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T细胞功能低下的问题，进而能够有效地提升CAR
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T治疗的效果，这为优化CAR
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T的设计提供了方向。
[0004]目前，已有的关于CAR
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T的优化设计策略主要包括：通过突变失活CD3ζ中不同ITAM区组合，降低CAR的信号；突变CD28共刺激结构域，降低CD28的共刺激信号；尝试不同结构组合，探索针对不同靶点的最适合、本底自激活水平最低的CAR结构形式；将参与调控T细胞增殖和分化的转录因子与CAR共同转导入T细胞中，以降低CAR
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T细胞的自激活信号、遏制T细胞的耗竭等。然而，这类设计往往需要对针对不同靶点的CAR进行尝试，耗费大量人力物力，且有误差大、普适性低等缺点。因此，针对CAR结构本身的、更具实用性与普适性的改造是更优化的方案。

技术实现思路

[0005]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种泛素偶联修饰的嵌合抗原受体及免疫细胞，用于解决现有技术中的问题。
[0006]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术首先提供一种嵌合抗原受体的改造方
法，所述改造方法包括将泛素偶联至嵌合抗原受体的C端。
[0007]本专利技术提供一种泛素修饰的嵌合抗原受体，所述泛素修饰的嵌合抗原受体包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞内域C端偶联有泛素。
[0008]本专利技术提供一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸包括编码所述泛素修饰的嵌合抗原受体的核苷酸。
[0009]本专利技术提供一种核酸构建体，所述核酸构建体中包括所述分离的多核苷酸。
[0010]本专利技术提供一种免疫细胞，所述免疫细胞中包括所述核酸构建体或基因组中整合有外源的所述的多核苷酸，或能够表达所述泛素修饰的嵌合抗原受体。
[0011]所述免疫细胞选自CAR
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T细胞、CAR
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NK细胞、CAR
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巨噬细胞或CAR
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TIL细胞。
[0012]本专利技术还提供所述免疫细胞的制备方法，所述制备方法包括将所述核酸构建体或所述多核苷酸导入免疫效应细胞或产生免疫效应细胞的干细胞中。
[0013]所述免疫效应细胞选自T细胞、NK细胞、巨噬细胞或TIL细胞。
[0014]本专利技术还提供所述免疫细胞在制备治疗癌症或免疫性疾病药物中的用途。
[0015]本专利技术还提供一种肿瘤或免疫性疾病的治疗方法，所述治疗方法包括向受试者施用治疗有效量的所述免疫细胞。
[0016]如上所述，本专利技术的泛素偶联修饰的嵌合抗原受体及免疫细胞，具有以下有益效果：为CAR
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T的优化改造提供方法，尤其是针对CAR
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T在实体瘤中增殖能力不佳的问题提供解决思路。本专利技术提供的简单易行且适用于不同靶点的高自激活水平CAR的优化改造方案，具有应用简单、可重复性高、普适性好和优化程度高、抗肿瘤活性好等优势，适用于各种现行的CAR
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T细胞生产技术，尤其适合于针对实体瘤靶点开发的CAR
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T治疗产品，为CAR
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T细胞本底自激活水平过高、增殖能力不佳、分化程度过高、耗竭过快等问题提供了一种新的解决思路。
附图说明
[0017]图1显示为在人类T淋巴瘤细胞系Jurkat中，检测构建的针对不同靶点的CAR
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T细胞系的自激活水平，利用测量T细胞激活水平的指征蛋白，如CD69、ICOS等的表达情况，评估这些细胞系的本底自激活水平，左图为检测的CD69表达水平，右图为检测的ICOS表达水平。如图所示，大量临床和临床前试验中采用的、针对不同靶标的CAR都会导致T细胞较高的本底自激活水平。尤其是针对实体肿瘤的GD2、Her2、CSPG4、EGFR、Meso、GPC3、多个靶点的CAR(核苷酸序列依次如SEQ ID NO.3
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11，氨基酸依次如SEQ ID NO.19
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27)，其本底自激活水平比较高。前人的研究证明CAR
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T细胞自激活水平过高会导致其过早分化、增殖能力下降、细胞耗竭水平提高、抗肿瘤杀伤能力大幅下降等结果，与其临床治疗效果不佳呈正相关。
[0018]图2
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1至图2
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3显示为将CD19
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28 WT
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CAR(核苷酸序列如SEQ ID NO.12，氨基酸序列如SEQ ID NO.28)以及在靶向CD19的CAR C端偶联一个野生型泛素(wtUb)(核苷酸序列如SEQ ID NO.13，氨基酸序列如SEQ ID NO.29)或者单泛素(monoUb)(核苷酸序列如SEQ ID NO.14，氨基酸序列如SEQ ID NO.30)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种嵌合抗原受体的改造方法，其特征在于，所述改造方法包括将泛素偶联至嵌合抗原受体的C端。2.一种泛素修饰的嵌合抗原受体，其特征在于，所述泛素修饰的嵌合抗原受体包括跨膜域、胞内域和胞外域，所述胞内域C端偶联有泛素。3.根据权利要求2所述的泛素修饰的嵌合抗原受体，其特征在于，还包括以下特征中的任一项或多项：1)所述跨膜域选自CD8α、CD28或DAP 10；2)所述胞内域包括共刺激结构域和/或信号结构域。4.根据权利要求3所述的泛素修饰的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内域选自以下中的一种或几种的组合：4
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1BB、CD28、OX40、ICOS、CD3ζ或DAP 10。5.根据权利要求2所述的泛素修饰的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体中依次包括CD8α信号肽、蛋白纯化标签、单链抗体、CD8α铰链组成的胞外域，CD8α跨膜域，CD28和CD3ζ串联组成的胞内域。6.根据权利要求5所述的泛素修饰的嵌合抗原受体，其特征在于，单链抗体选自GD2 scFv、GPC3 scFv、Her2 scFv、CSPG4 scFv、EGFR scFv、Meso scFv、TRBC1 scFv、CD133 scFv、BCMA scFv或CD19 scFv。7.根据权利要求2所述的泛素修饰的嵌合抗原受体，其特征在于，所述泛素选自野生型泛素或突变型泛素。8.根据权利要求2所述的泛素修饰的嵌合抗原受体，其特征在于，所述泛素选自突变型泛素，所述突变型泛素的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。9.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述分离的多核苷酸包括编码权利要求2
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8任一所述的泛素修饰的嵌合抗原受体的核苷酸。10.一种核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体中包括权利要求9所述的多核苷酸。11.一种免疫细胞，其特征在于，所述免疫细胞中包括权利要求10所述的核酸构建体或...

【专利技术属性】
技术研发人员：王皞鹏，邱士真，李文涛，王琨，陈健，宋献民，
申请(专利权)人：上海科技大学，
类型：发明
国别省市：