EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及病毒检测领域，具体涉及EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒。本发明专利技术通过抗原筛选，获得了以天然抗原gp125蛋白为抗原的EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒，并对其中试剂进行了优化，降低检测背景的同时增加了抗体的稳定性。经实验表明，本发明专利技术所述的EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒稳定性好、特异性强、灵敏度高，同时本发明专利技术的EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒结构简单，用于EB病毒检测的时间成本低、稳定性好，可以与全自动化学发光仪结合实现全自动高通量检测，具有较强的临床应用意义。义。

【技术实现步骤摘要】
EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒


[0001]本专利技术涉及病毒检测领域，具体涉及EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒。

技术介绍

[0002]EB病毒(Epstein
‑
Barr virus，EBV)属于疱疹病毒科γ亚科，主要侵犯B淋巴细胞，EB病毒感染引起细胞的异常增生和转化。研究发现，EB病毒具有易感性，与多种人类恶性肿瘤密切相关，如鼻咽癌、传染性单核细胞增多症(Infectious monon
‑
ucleosis，IM)和伯基特淋巴瘤等。EB病毒增殖后期，合成大量的VCA结构蛋白，与病毒DNA组成核衣壳，并进一步装配成完整的病毒体。参考EB病毒衣壳抗原IgM抗体的滴度，可以对IM患者的临床感染周期进行相应的评估。
[0003]现有的EB病毒的检测方法都存在一定的缺陷，如病毒分离法耗时且培养条件要求高，不适于常规临床应用，免疫酶法稳定性差、操作繁琐且技术要求高，基层应用不便，酶联免疫法反应时间长且自动化程度低，胶体金层析法成本昂贵且准确度低。而磁微粒化学发光法稳定性好、操作简单、响应快速、特异性强、灵敏度高，可以实现样本的全自动化高通量检测，但目前就磁微粒化学发光中存在抗体稳定性差、易受背景干扰等问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒。
[0005]本专利技术提供了试剂组合，其包括酶结合物、样品稀释液和磁微粒悬液；
[0006]所述酶结合物为抗人IgM；
[0007]所述样品稀释液包括抗人IgG；
[0008]所述磁微粒悬液中的磁微粒包被有EB病毒衣壳抗原；所述抗原分子量为为125
±
10kD。
[0009]本专利技术中，所述EB病毒衣壳抗原的制备方法为：以EB病毒株侵染细胞，裂解侵染细胞并分离纯化得到EB病毒衣壳抗原。
[0010]进一步的，本专利技术所述的试剂组合中，
[0011]酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人IgM；
[0012]样品稀释液的溶剂为PBS缓冲液，所述样品稀释液包括体积分数为1％～3％的抗人IgG；
[0013]磁微粒悬液的缓冲液为含有体积分数为20％～50％小牛血清的Tris缓冲液，所述磁微粒悬液中EB病毒衣壳抗原的工作浓度为10μg/mL～250μg/mL；所述磁微粒的直径为0.2μm～4μm，磁微粒的种类为羧基磁微粒。
[0014]更进一步的，本专利技术所述的试剂组合中，样品稀释液还包括体积分数为1％～5％的抗人IgA、体积分数为20％～50％的小牛血清、浓度为1mg/mL～5mg/mL的蛋白稳定剂和体积分数为0.5％～3％的防腐剂；所述蛋白稳定剂为多羟基糖类，所述多羟基糖类包括但不
限于蔗糖；所述防腐剂包括P300。
[0015]在本专利技术的一些具体实施例中，
[0016]所述的样品稀释液为：体积分数为2％的抗人IgG、体积分数为2％的抗人IgA、体积分数为30％的小牛血清、浓度为2mg/mL的蔗糖和体积分数为1％的P300。
[0017]所述的磁微粒悬液的缓冲液为含有体积分数为30％的小牛血清的Tris缓冲液，所述磁微粒悬液中EB病毒衣壳抗原的工作浓度为50μg/mL。
[0018]本专利技术中，所述样品稀释液中的抗人IgG和抗人IgA与酶结合物中的抗人IgM的来源保持一致，当所述抗人IgM来源为羊时所述抗人IgG和抗人IgA的来源也为羊，当所述抗人IgM来源为兔时所述抗人IgG和抗人IgA的来源也为兔。所述抗人IgM的来源包括羊、人、鼠、鸡、兔、猪。在本专利技术的一些具体实施例中，所述抗人IgM为羊抗人IgM，所述抗人IgG为羊抗人IgG，所述抗人IgA为羊抗人IgA。
[0019]本专利技术中，所述样品稀释液中添加与抗体相同来源的抗人IgG可降低检测背景，减少IgG对IgM的干扰，增加反应的特异性。同时在所述样品稀释液进一步添加抗人IgA，使检测特异性和灵敏度进一步提高。
[0020]本专利技术中，所述的磁微粒悬液中的磁微粒上包被有EB病毒衣壳抗原，其为天然gp125抗原，其通过侵染EB病毒株P3H3的细胞裂解纯化得到，其分子量为125
±
10kD、纯度≥30％。实验结果表明，以本专利技术所述的天然gp125蛋白为抗原制备的EB病毒磁微粒化学发光检测试剂盒的发光值最高且阴阳反差最大，与其他抗体相比具有良好的抗原性和特异性。
[0021]本专利技术的试剂组合中，所述磁微粒悬制备方法包括：在EDC溶液和NHS溶液活化后的磁微粒上包被EB病毒衣壳抗原，然后依次经终止液处理和封闭液处理后获得所述磁微粒悬浮液。
[0022]本专利技术所述磁微粒悬液制备方法中，EDC溶液和NHS溶液活化的时间为0.5～2小时；所述活化前还包括利用PBS缓冲液清洗的步骤，清洗次数为3～8次；所述活化后还包括用MES缓冲液清洗的步骤，清洗次数为2～5次。
[0023]本专利技术所述磁微粒悬液制备方法中，
[0024]包被天然gp125抗原的条件为：18～28℃下震荡温育1～3小时。
[0025]终止液为含有体积分数为1％～5％ PEG 8000的PBS缓冲液；终止液处理的条件为：25℃下震荡2小时。
[0026]封闭液为含浓度为1mg/mL～5mg/mL蛋白稳定剂的Tris缓冲液；所述蛋白保护剂为多羟基糖类；多数的多羟基糖类包括但不限于蔗糖；所述封闭液处理条件为：25℃下封闭3次，每次20min。
[0027]本专利技术的一些具体实施例中，
[0028]所述的终止液为含有体积分数为1.5％ PEG 8000的PBS缓冲液；封闭液为含浓度为2mg/mL蔗糖的Tris缓冲液。
[0029]本专利技术提供了EB病毒的检测方法，其为利用本专利技术所述的试剂组合进行样本EB病毒的检测。
[0030]进一步的，所述的检测方法的步骤包括：将样品、样品稀释液和磁微粒悬液混匀，第一温育，加入酶结合物，第二温育，洗涤和加入发光试剂检测发光。
[0031]更进一步的，所述的检测方法中，
[0032]样品、样品稀释液、磁微粒悬液、酶结合物的体积比为10：1：2：10；
[0033]第一温育为37℃温育15分钟；
[0034]第二温育为37℃温育17分钟；
[0035]洗涤的试剂为pH为7.5～8.5的PBS缓冲液；
[0036]发光试剂包括A液和B液；所述A液包括过氧化氢；所述B液包括鲁米诺。
[0037]在一些具体的实施例中，本专利技术所述的洗涤试剂为为pH为8.0的PBS缓冲液。
[0038]本专利技术所述的检测方法，其包括诊断目的和非诊断目的的检测方法，本专利技术对此不做限定。所述非诊断目的的检测方法包括对环境样本、食物、饮用水中，或生物体离体样本是否含有EB病毒进行检测；所述诊断目的的检测方法包括对生物体是否含有EB病毒进行检测。
[0039]本专利技术提供了EB病毒检测试剂盒，其包括校准品1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.试剂组合，其特征在于，包括酶结合物、样品稀释液和磁微粒悬液；所述酶结合物为抗人IgM；所述样品稀释液包括抗人IgG；所述磁微粒悬液中的磁微粒包被有EB病毒衣壳抗原；所述抗原分子量为为125
±
10kD。2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述磁微粒悬液中EB病毒衣壳抗原的制备方法为：以EB病毒株侵染细胞，裂解侵染细胞并分离纯化得到EB病毒衣壳抗原。3.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述酶结合物为辣根过氧化物酶标记的抗人IgM；所述样品稀释液的溶剂为PBS缓冲液，所述样品稀释液包括体积分数为1％～3％的抗人IgG；所述磁微粒悬液的缓冲液为含有体积分数为20％～50％小牛血清的Tris缓冲液，所述磁微粒悬液中EB病毒衣壳抗原的工作浓度为10μg/mL～250μg/mL；所述磁微粒的直径为0.2μm～4μm，磁微粒的种类为羧基磁微粒。4.根据权利要求1或3所述的试剂组合，其特征在于，所述样品稀释液还包括体积分数为1％～5％的抗人IgA、体积分数为20％～50％的小牛血清、浓度为1mg/mL～5mg/mL的蛋白稳定剂和体积分数为0.5％～3％的防腐剂；所述蛋白稳定剂为多羟基糖类；所述防腐剂包括P300。5.根据权利要求1～4任一项所述的试剂组合，其特征在于，所述磁微粒悬制备方法包括：在EDC溶液和NHS溶液活化后的磁微粒上包被EB病毒衣壳抗原，然后依次经终止液处理和封闭液处理后获得所述磁微粒悬浮液；所述EDC溶液和NHS溶液活化的时间为0.5～2小时；所述活化前还包括利用PBS缓冲液清洗的步骤，清洗次数为3～8次；所述活化后还包括用...

【专利技术属性】
技术研发人员：许东勤，吴文娟，王新明，郑凯，丁瑞贤，
申请(专利权)人：郑州安图生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：