一种金属纳米粒子试剂盒及其制备方法与在湿疹标志物检测中的应用技术

本发明专利技术公开了一种金属纳米粒子试剂盒及其制备方法与在湿疹标志物检测中的应用，所述金属纳米粒子试剂盒利用化学自组装法将金属纳米粒子沉积在试剂盒孔板表面，通过Ag

【技术实现步骤摘要】
一种金属纳米粒子试剂盒及其制备方法与在湿疹标志物检测中的应用


[0001]本专利技术属于生化分析
，具体涉及一种金属纳米粒子试剂盒及其制备方法与在湿疹标志物检测中的应用。

技术介绍

[0002]湿疹实质上是由多种内外因素引起的瘙痒剧烈的一种皮肤炎症反应。炎症是一个复杂和高度调节的过程，通过炎症，身体对外界刺激和感染做出自我保护反应。然而，过度炎症是各种长期炎症性疾病甚至癌症发展的前体，如糖尿病、关节炎、哮喘、结肠癌等。当炎症发生时，白细胞，包括机体中的巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞，被激活并产生促炎因子白细胞介素6(IL
‑
6)、肿瘤坏死因子α(TNF
‑
α)和白细胞介素1β(IL
‑
1β)，引发正常组织的凋亡和坏死。白细胞介素6(IL
‑
6)是一种多肽物质，广泛参与慢性炎症和组织再生和造血等生理活动，特别是急性炎症，其水平的升高通常用于确定细菌感染引发的炎症反应，因此，它是大多数炎症性疾病的重要检测手段。
[0003]目前已经开发了一系列检测白介素6(IL
‑
6)的方法，如化学发光免疫法、酶联免疫吸附法(ELISA)、荧光免疫法、比色法和电化学免疫法。其中，ELISA被认为是检测IL
‑
6最常规和标准的方法，特异性和敏感性约为5
‑
10pg/ml。但该方法操作繁琐，检测时间长。因此，迫切需要开发一种更先进、可靠和快速的技术来检测复杂生物系统中的IL
‑
6。r/>[0004]近年来，表面增强拉曼散射(SERS)技术凭借其独特的指纹振动光谱和超窄谱线宽度在生物分子分析中显示出了巨大的潜力。但是，蛋白质的拉曼散射截面较低，分子结构中缺少发色团部分，无法提供较强的SERS信号，因此SERS 技术无法直接检测蛋白质。使用SERS技术与高特异性生物分子结合的间接传感技术可以显著提高SERS技术在蛋白质定量和表征方面的应用效果。
[0005]核酸适配体是通过体外筛选得到的一类单链DNA或RNA分子，这类分子能够发挥与抗体相同的亲和识别功能，但是具有优于抗体的特性。这类分子可以体外大量合成，缩短了制备周期，DNA分子不易受环境等因素的影响，具有比抗体更高的稳定性，同时DNA分子易于修饰功能性基团，其引入的氨基、羧基、巯基、生物素、荧光素等分子更易进行传感检测方法的构建。因此随着纳米传感技术的发展，将纳米材料与适配体结合构建的纳米传感器在生物检测领域发挥着越来越重要的作用。其中应用最广泛的纳米粒子是纳米金、纳米银等贵金属纳米粒子，这种纳米粒子具有易于合成、小尺寸效应、表面效应、光学效应和良好的生物相容性。
[0006]公开号为CN110261621A的专利“一种白介素
‑
6检测试剂盒”，其中通过引入链霉亲和素
‑
生物素信号放大系统，实现对白介素
‑
6的准确定量；但该专利技术需要使用增敏剂、防腐剂和表面活性剂，以避免受到待检测样本中某些物质(如脂类)的干扰，降低非特异性的结合，影响结果的准确度；公开号为 CN107727632A的专利公开了“一种SERS增强的可控链状组装体检测凝血酶的方法”，利用适配体分子与凝血酶的识别与结合，实现凝血酶的定量检
测，但是此方法需要Au@Ag纳米粒子和Ag纳米粒子分子分别修饰凝血酶的两种适配体DNA分子，并且需要控制适配体DNA分子在纳米粒子上的修饰量。

技术实现思路

[0007]本专利技术介绍了一种金属纳米粒子试剂盒及其制备方法与在湿疹标志物检测中的应用，本专利技术利用Ag
‑
S键的作用在试剂盒孔板表面制备
[0008]Au@MBN@Ag
‑
ADNA
‑
CDNA结构，形成核酸适体传感器。该核酸适体传感器在存在湿疹标志物的情况下，ADNA链与湿疹标志物特异性结合形成3D构象实现捕获功能，通过范德华力、氢键和静电作用形成稳定的蛋白
‑
适体复合物。同时，由于ADNA链和靶蛋白之间的亲和力远远大于适体，带有Cy3信号的CDNA 链将会被靶蛋白的竞争性结合所取代，使得CDNA链的脱落，将导致Cy3的拉曼信号降低。随着靶蛋白的浓度增加，CDNA链脱落的越多，其Cy3的拉曼信号与靶蛋白浓度呈负相关。此外使用4MBN作为内标分子，可以对SERS信号进行动态校准，形成自校准适体传感器。
[0009]本专利技术的技术方案如下：
[0010]本专利技术的目的之一在于提供一种金属纳米粒子试剂盒的制备方法，利用化学自组装法将金属纳米粒子沉积在试剂盒孔板表面，通过Ag
‑
S键的作用在金属纳米粒子表面修饰上ADNA，继而通过ADNA链和CDNA链的互补配对过程，将一端带有Cy3的CDNA链靠近金属纳米粒子，形成核酸适体传感器。
[0011]进一步的，所述制备方法具体如下：
[0012]S1、Au NPs的制备：在剧烈搅拌下将柠檬酸钠溶液添加于沸腾的氯金酸水溶液中，当溶液再次沸腾后，在搅拌下保持该状态10
‑
20min，然后将溶液自然降至室温，将制得的金纳米颗粒保存在4℃下以备将来使用；
[0013]S2、Au@MBN@Ag NPs溶液的制备：将Au NPs加入MBN溶液，搅拌后离心除去多余的MBN溶液，重悬于蒸馏水中，然后加入硝酸银溶液和抗坏血酸溶液，搅拌30min；
[0014]S3、制备修饰有金属纳米粒子的孔板：将试剂盒孔板用乙醇洗涤，在2
‑
6℃下浸入3
‑
巯基丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中24h，然后将孔板用乙醇洗涤三次并在氮气下干燥，最后浸入Au NPs或Au@MBN@Ag NPs中；
[0015]S4、制备Au@MBN@Ag
‑
ADNA
‑
CDNA结构：将制得的孔板分别加入ADNA 和CDNA溶液，于摇床中孵育；
[0016]进一步的，所述S1中柠檬酸钠溶液浓度为1wt％，体积为1
‑
3mL，氯金酸水溶液浓度为0.01wt％，体积为80
‑
120mL。
[0017]进一步的，所述S2中所述S2中MBN溶液浓度为1
×
10
‑5M，体积为20μL；硝酸银溶液浓度为1mM，体积为100
‑
150μL；抗坏血酸溶液浓度为0.01mM，体积为80μL；搅拌时间为30min。
[0018]进一步的，所述S3中浸入时间为6
‑
24h。
[0019]进一步的，所述S4中摇床的振荡速度为120rpm，摇床的温度为37℃，孵育时间为12h。
[0020]进一步的，所述S4中
[0021]ADNA序列为5
’‑
SH
‑
(CH2)6
‑
CTTCCAACGCTCGTATTGTAGTCTTTAGT
‑3’<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种金属纳米粒子试剂盒的制备方法，其特征在于：利用化学自组装法将金属纳米粒子沉积在试剂盒孔板表面，通过Ag
‑
S键的作用在金属纳米粒子表面修饰ADNA，继而通过ADNA链和CDNA链的互补配对过程，将一端带有Cy3的CDNA链靠近金属纳米粒子，形成核酸适体传感器。2.如权利要求1所述的一种金属纳米粒子试剂盒的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、Au NPs的制备：在剧烈搅拌下将柠檬酸钠溶液添加于沸腾的氯金酸水溶液中，当溶液再次沸腾后，在搅拌下保持该状态10
‑
20min，然后使溶液自然降至室温，将制得的金纳米颗粒保存在4℃下；S2、Au@MBN@Ag NPs溶液的制备：将S1中制得的Au NPs加入MBN溶液，搅拌后离心除去多余的MBN溶液，重悬于蒸馏水中，然后加入硝酸银溶液和抗坏血酸溶液搅拌；S3、制备修饰有金属纳米粒子的孔板：将试剂盒孔板用乙醇洗涤，在2
‑
6℃下浸入3
‑
巯基丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中24h，然后将孔板用乙醇洗涤三次并在氮气下干燥，最后浸入Au NPs或Au@MBN@Ag NPs中；S4、制备Au@MBN@Ag
‑
ADNA
‑
CDNA结构：将制得的孔板分别加入ADNA和CDNA溶液，于摇床中孵育。3.如权利要求2所述的一种金属纳米粒子试剂盒的制备方法，其特征在于，所述S1中柠檬酸钠溶液浓度为1wt％，体积为1
‑
3mL，氯金酸水溶液浓度为0.01wt％，体积为80
‑
120mL。4.如权利要求2所述的一种金属纳米粒子试剂盒...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄倩，王楚怡，游瑞云，吴阳，刘云珍，卢玉栋，朱兰瑾，王浩楠，沈慧英，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：