筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法及应用技术

本发明专利技术属于微生物技术领域中的细菌筛选分离，公开了一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌的方法包括：通过比较确定产琼胶酶菌株的高效富集培养基H，构建产芳基硫酸酯酶菌株鉴定方法，筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。本发明专利技术提供了一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，可用于筛选催化效率高、稳定性强的琼胶降解酶，进而以绿色、高效和经济的方式提高琼胶寡糖的产量和质量。本发明专利技术能为琼胶寡糖的工业化生产提供条件，可有效地推动海洋多糖活性物质的绿色开发和高效利用，加快发展海洋经济。济。济。

【技术实现步骤摘要】
筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法及应用


[0001]本专利技术属于细菌筛选分离
，尤其涉及一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法及应用。

技术介绍

[0002]琼胶是目前使用最为广泛的三大海藻糖之一，是龙须菜、麒麟菜等红藻中细胞壁外层的主要成分，在食品和医药等方面应用广泛。但由于琼胶黏度高/水溶性低，不易被吸收，在应用上受到较大的限制。为了解决这个问题，可利用酸法/酶法进行降解获得琼胶寡糖。琼胶寡糖水溶性好，易吸收，极大的提高了琼胶的应用价值，是一种新型的海洋功能性低聚糖。
[0003]目前，国内外主要采用酸降解法和酶法制备琼胶寡糖。酸降解法应用最广泛，降解得到的寡糖得率高，但存在产物不均一、需要高温酸解、污染环境、寡糖活性丧失、产物分析和回收难等问题，故而难以工业化生产功能性寡糖，以满足社会需求。酶法能够克服酸降解法存在的不足，具有分解条件温和、易控制，产物专一性好、易于分离纯化和分析且活性高，工艺绿色环保等优点。
[0004]琼胶主要由琼脂糖和硫琼胶两部分组成。其中，琼脂糖是琼胶的主要组成部分，为形成凝胶的一种中性链状多糖；而硫琼胶的结构较为复杂，主要碳链结构与琼脂糖的相同，但含更多的硫酸基。硫酸基需通过碱或芳基硫酸酯酶处理才能脱除，转化为低硫酸基的琼脂糖，从而充分利用硫琼胶这一长期以来被看做提取琼脂糖的废弃物。此外，芳基硫酸酯酶具有断裂硫酸酯键的功能，并可应用于酶法脱除琼胶上的硫酸基，提高凝胶强度，改善琼胶性能，用于制备高品质的琼脂糖。
[0005]硫琼胶经芳基硫酸酯酶脱硫变为琼脂糖，在琼胶酶的作用下生成琼胶寡糖。琼胶寡糖具有多种生物活性，能抵抗病毒、抗肿瘤/抗氧化和抗炎症，能够增强免疫力，具有保湿和美白等作用，可以作为天然的防腐剂、抗氧化剂和功能性食品基料等，在医药、食品、生物技术和化妆品等多个领域具有广泛的应用前景，开发潜力极大。
[0006]琼胶降解酶来源少、活性低，目前仅有Pseudomonas atlantica菌株的β
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琼胶酶和Flammeovirgapacifica菌株的芳基硫酸酯酶应用于生产，但产量少且价格昂贵。报道的产琼胶酶的琼胶降解菌主要分布在假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、噬琼胶菌属(Agarivorans)、交替单胞菌属(Alteromonas)等类群中。除了Flammeovirga属于拟杆菌门(Bacteroidetes)外，其余菌株均属于变形菌门(Proteobacteria)γ
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变形菌纲(Gamma
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proteobacteria)。应用于琼胶脱硫的产芳基硫酸酯酶菌株仅有数株，同时含有琼胶酶和芳基硫酸酯酶的菌株尚未有报道。因此，建立分离同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，将为提高琼胶利用率和增加琼胶寡糖产量提供丰富的菌种资源和酶资源，与国家着力促进海洋经济“绿色发展”的理念相呼应，实现经济效益和环境保护的双重目标。
[0007]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术没有能够筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法；现有的琼胶寡糖制备方法产物不均一、需要高温酸
解、污染环境、寡糖活性丧失、产物分析和回收难，难以进行工业化生产功能性寡糖。

技术实现思路

[0008]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法及应用。
[0009]本专利技术是这样实现的，一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法包括：
[0010]通过比较确定产琼胶酶菌株的高效富集培养基H，构建产芳基硫酸酯酶菌株鉴定方法，筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。
[0011]进一步，所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法包括以下步骤：
[0012]步骤一，将沉积物或海水样品加入富集培养基H中颠倒混匀，并进行培养，得到培养液；
[0013]步骤二，将得到培养液与9倍量的富集培养基H混合后进行稀释，并将稀释液涂布于2216E固体培养基，进行培养，分离纯化获得单菌落；
[0014]步骤三，挑取单菌落于2216E液体培养基中进行过夜培养，将卢戈氏碘液覆盖于2216E培养基平板上菌落的周边区域，产生透明圈的即为产琼胶酶细菌；
[0015]步骤四，将单菌落的过夜培养液进行划线培养，平板分为两等份，一份涂对硝基苯酚硫酸酯盐pNPS，另一份涂等量的PBS缓冲液，仅涂pNPS的平板变为淡黄色的菌株，即为同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的细菌。
[0016]进一步，所述沉积物或海水样品与所述富集培养基H的体积比为1:9。
[0017]进一步，所述富集培养基H由0.05％的MgSO4·
7H2O、0.1％的琼胶、0.002％的FeSO4·
7H2O、0.02％的CaCl2、2.5％的NaCl、0.2％的NaNO3以及0.1％的K2HPO4组成；所述富集培养基pH为7.5。
[0018]进一步，所述步骤一中进行培养包括：于28℃下培养48小时；所述步骤二中进行培养包括：于28℃下培养48小时。
[0019]进一步，所述步骤二中，进行单菌落的挑选包括：确定固体培养基上菌株的生长情况，挑选不同菌落形态特别是形成平板凹陷乃至产生孔洞的细菌进行纯化，经多次划线培养后得到单菌落。
[0020]进一步，所述步骤三中，培养包括：取10μL单菌落过夜培养液，滴在2216E固体培养基上，于28℃、150rpm下培养24小时；所述步骤四中进行培养包括：挑取单菌落进行平板划线培养，将2216E固体培养基分为两等份，分别涂抹50μLPBS缓冲液与终浓度为5mM的pNPS，28℃培养48小时。
[0021]进一步，所述步骤三中，将卢戈氏碘液覆盖菌落的周边区域，呈现透明圈的菌落为产琼胶酶海洋细菌；
[0022]进一步，所述步骤四中，涂pNPS的平板变为淡黄色，而涂PBS缓冲液的不变色，得到产芳基硫酸酯酶的海洋细菌。
[0023]本专利技术的另一目的在于提供一种基于所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌方法进行高效琼胶菌筛选的方式。
[0024]结合上述的技术方案和解决的技术问题，本专利技术所要保护的技术方案所具备的优
点及积极效果为：
[0025]本专利技术提供了一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，可用于筛选催化效率高、稳定性强的琼胶降解酶，进而以绿色、高效和经济的方式制备高品质的琼脂糖以提高琼胶寡糖的产量和质量。
[0026]本专利技术绿色环保，不会污染环境，且筛选效率高。
[0027]本专利技术将为提升琼胶利用率、提高琼胶寡糖产量和质量提供丰富的菌种资源和酶资源，能为琼胶寡糖的工业化生产提供条件，可有效地推动海洋多糖活性物质的绿色开发和高效利用，加快发展海洋经济。
[0028]本专利技术的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本专利技术能提本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法通过比较确定产琼胶酶菌株的高效富集培养基H，构建产芳基硫酸酯酶菌株鉴定方法，筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。2.如权利要求1所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法包括以下步骤：步骤一，将沉积物或海水样品加入富集培养基H中颠倒混匀，并进行培养，得到培养液；步骤二，将得到培养液与9倍量的富集培养基H混合后进行稀释，然后涂布于2216E固体培养基，进行培养，分离纯化获得单菌落；步骤三，挑取单菌落于2216E液体培养基中进行过夜培养，将卢戈氏碘液覆盖2216E培养基平板上的菌落的周边区域，产生透明圈的即为产琼胶酶细菌；步骤四，将单菌落的过夜培养液进行划线，平板分为两等份，一份涂pNPS，另一份涂等量的PBS缓冲液，进行培养，涂pNPS的平板变为淡黄色即为产芳基硫酸酯酶的细菌。以此筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。3.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述沉积物或海水样品与所述富集培养基H的体积比为1：9。4.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述富集培养基H由0.05％的MgSO4·
7H2O、0.1％的琼胶、0.002％的FeSO4·
7H2O、0.02％的CaCl2、2.5％的NaCl、0.2％的NaNO3以及0.1％的K2HPO4组...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹群健，汤弘智，朱方超，汤丽昌，李学恭，陈旭阳，于硕，程德伟，
申请(专利权)人：自然资源部第四海洋研究所中国—东盟国家海洋科技联合研发中心，
类型：发明
国别省市：