一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法及其应用，特点是包括以下步骤：1）向健康对虾养殖系统输入碳氮比为10:1

【技术实现步骤摘要】
一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法及其应用


[0001]本专利技术属于对虾生态养殖
，尤其是涉及一种基于生物絮团养殖对虾的粪菌富集液的制备方法及其应用。

技术介绍

[0002]凡纳滨对虾是世界三大对虾养殖品种之一，但病害频发导致它的产量和质量都不稳定，成为制约对虾养殖业发展的瓶颈问题。目前，生物防治已成为克服水产动物病害的重要途径之一，而利用微生物制剂防治对虾弧菌病日益受到国内外的重视。尽管大部分养殖企业在养殖全程都使用一种或多种微生物制剂，但仍无法避免对虾弧菌病害的发生。其原因主要为：一是市面上的制剂产品大多从陆源照搬过来，针对性不强，应用效果不显著；二是尽管人们从对虾养殖系统筛选了很多拮抗弧菌的菌株，但其应用主要在实验室完成，而在实际应用中效果不稳定。很多微生物组研究已经表明肠道微生物群落核心类群集合而不是单一的微生物在维持对虾健康和保护对虾免受病原体感染中发挥着更重要的作用。
[0003]对虾肠道包含大量微生物，其在对虾生长、消化和抗病等方面发挥着重要作用。因此，如能将对虾肠道微生物进行富集并应用于对虾养殖实践中，将有望提升对虾的抗病性能。近期我们通过弧菌侵染和粪便移植试验，证明了生物絮团模式下养殖对虾的肠道菌群能有效提升对虾抗弧菌侵染性能，为抗病型肠道菌群，但如何将絮团虾肠道微生物进行长期保存、扩繁及其应用到对虾养殖过程中等还没有成熟的方案和解决办法。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种促进对虾生长和抗弧菌病的基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法及其应用。
[0005]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法，包括以下步骤：（1）向健康对虾养殖系统输入碳氮比为10:1~15:1的碳源和饲料混合物，定向塑造对虾肠道微生物群落；（2）在无菌条件下采集步骤（1）养殖的对虾肠道样品与无菌磷酸缓冲液充分混合后，接种于富集培养基中进行扩繁后，即获得肠道粪菌富集液。
[0006]进一步，步骤（1）具体为：向健康对虾养殖系统输入碳氮比为10:1~15:1的碳源和饲料混合物，每天投喂3~6次，养殖期间不换水，对虾起始生物量控制在400~1200 g/m3范围，养殖10~30天后，对虾肠道定向富集促生长和抗病原菌侵染的健康微生物群落。根据养殖经验，在养殖10~15天时养殖水体开始形成大量生物絮团，此时对虾肠道微生物群落发生显著改变，可通过弧菌侵染和粪便移植试验验证絮团虾肠道微生物抗弧菌侵染的特性。我们多次的试验证明，按照上述要求持续添加碳源7~28天后，对虾肠道微生物均有抗弧菌侵染的特性。
[0007]进一步，所述的碳源为红糖、糖蜜、蔗糖或葡萄糖。
[0008]进一步，所述的碳源添加量=对虾饲料投喂量
×
0.45
×
0.16
×
0.75
×
碳氮比
×2÷
0.842，所述的对虾饲料投喂量为对虾总的生物量的3~7%。
[0009]进一步，步骤（2）具体为：在无菌条件下采集步骤（1）养殖的对虾肠道样品与无菌磷酸缓冲液按质量体积比1/10g/mL~1/5 g/mL充分混合后，按接种体积0.2~0.5%的比例接种于富集培养基中，于25~30℃，180 ~200 rpm培养36 ~48 h，即可获得肠道粪菌富集液，肠道粪菌富集液加入15vt%~30vt%甘油后，于
‑
80℃冰箱长期保存。
[0010]进一步，所述的富集培养基配方如下：葡萄糖0.3~0.6 g，蛋白胨0.3 g~0.6 g，可溶性淀粉0.4 g~0.6 g，酵母提取物0.4 g~0.6 g，丙酮酸钠0.2 g~0.4 g，酸水解酪素0.4 g~0.5 g，海水750 mL和蒸馏水250 mL，pH调至6.5~7.5。
[0011]上述制备方法得到的肠道粪菌富集液的应用，将所述的肠道粪菌富集液离心后用PBS缓冲液重悬至OD
600
为1.6~2.2的悬浮液后，移植10 μL~50 μL菌液到对虾肠道即可。可显著提高对虾的抗病性能。
[0012]上述制备方法得到的肠道粪菌富集液的应用，每次喂料前，将肠道粪菌富集液与饲料混合发酵10~30 min，使肠道粪菌富集液菌浓度为106~10
8 CFU/g饲料，发酵结束后投喂对虾，饲料投喂量为对虾总的生物量的3~7%。该富集液添加到对虾养殖系统后可以使对虾肠道变粗，提高对虾成活率和病原菌侵染抗性。
[0013]与现有技术相比，本专利技术的优点在于：1、通过弧菌侵染和粪便移植试验证明，与传统换水养殖对虾相比，絮团模式下养殖对虾的肠道可定向富集潜在益生微生物类群，该菌群具有抗弧菌侵染的特性。本技术中对虾肠道粪菌富集液原始菌种来自生物絮团模式下养殖对虾的肠道，经富集培养获得，该富集菌液可以作为种子液长期保存。
[0014]2、该专利技术中的对虾肠道粪菌富集液中微生物本身来自于对虾肠道，作为复合型微生物制剂应用到对虾养殖中，更易适应对虾养殖环境，提高对虾产量和存活率；3、该专利技术中的对虾肠道粪菌富集液可作为对虾养殖的益生菌添加剂，直接与饲料发酵投喂对虾，投喂发酵饲料后使对虾肠道变粗，成活率更高，并且显著增加了对细菌型病原菌侵染的抗性。
[0015]综上所述，本专利技术首次报道了一种将生物絮团养殖对虾的肠道粪菌进行富集和应用的方法，通过添加碳源塑造出促生长和抗弧菌病的对虾肠道微生物，对其进行定向富集后可长期保存，所述的健康对虾肠道富集液能够促进对虾生长、消化和抗细菌性病原菌侵染，显著提高对虾成活率和病原菌侵染抗性，具有广阔的应用前景。
附图说明
[0016]图1为本专利技术生物絮团养殖和对照养殖对虾20天后对虾照片（A）、存活率（B）、单虾体长（C）和单虾体重（D）；图2为本专利技术生物絮团养殖和对照养殖对虾20天后弧菌侵染存活曲线（A）和对虾照片（B），其中WES表示对照组，BFS表示碳源组；图3为本专利技术生物絮团养殖对虾粪菌富集液移植后弧菌侵染抗性差异；图4为本专利技术生物絮团养殖对虾粪菌富集液和饲料发酵投喂幼虾6天后肠道变化
照片（A）和成活率差异（B）；图5本专利技术生物絮团养殖对虾粪菌富集液和饲料发酵投喂幼虾6天后弧菌侵染抗性差异。
具体实施方式
[0017]以下结合附图实施例对本专利技术作进一步详细描述。
[0018]一、具体实施例本专利技术通过生物絮团养殖对虾20天使对虾肠道定向富集促生长和抗病原菌侵染的健康微生物群落，具体方法如下：1、在规范一致的养殖体系中，注入消毒海水，投放规格一致的健康对虾，养殖实验过程维持养殖系统温度在22~28℃，盐度为20~30 ppt。培养期间每天投喂饲料（普生0号饲料，成分：粗蛋白≥45%，粗脂肪≥7%，赖氨酸≥2.6%，粗纤维≤6%，粗灰分≤16%，总磷≥1%）占对虾总湿重的3~7%。根据对虾生长适当调节投喂饲料的量，投放的起始对虾体重为2~4 g，养殖密度为200~300只/m本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法，其特征在于包括以下步骤：（1）向健康对虾养殖系统输入碳氮比为10:1~15:1的碳源和饲料混合物，定向塑造对虾肠道微生物群落；（2）在无菌条件下采集步骤（1）养殖的对虾肠道样品与无菌磷酸缓冲液充分混合后，接种于富集培养基中进行扩繁后，即获得肠道粪菌富集液。2.根据权利要求1所述的一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法，其特征在于步骤（1）具体为：向健康对虾养殖系统输入碳氮比为10:1~15:1的碳源和饲料混合物，每天投喂3
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6次，养殖期间不换水，对虾起始生物量控制在400~1200 g/m3范围，养殖10~30天后，对虾肠道定向富集促生长和抗病原菌侵染的健康微生物群落。3.根据权利要求2所述的一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法，其特征在于：所述的碳源为红糖、糖蜜、蔗糖或葡萄糖。4.根据权利要求2所述的一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法，其特征在于：所述的碳源添加量=对虾饲料投喂量
×
0.45
×
0.16
×
0.75
×
碳氮比
×2÷
0.842，所述的对虾饲料投喂量为对虾总的生物量的3~7%。5.根据权利要求1所述的一种基于生物絮团养殖对虾的肠道粪菌富集液的制备方法，其特征在于步骤（2）具体为：在无菌条件下采...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭海朋，符学志，张德民，
申请(专利权)人：宁波大学，
类型：发明
国别省市：