具有铰链结构域的人源化Notch受体制造技术

本公开文本总体上尤其涉及含有完全人源化转录效应子的新类别的嵌合Notch受体，其被工程化为以配体依赖性方式调节基因表达和细胞活性。新嵌合Notch受体令人惊讶地保留了响应于配体结合而转导信号的能力，尽管完全不存在Notch胞外亚基(NEC)，其包括先前被认为对于Notch受体发挥功能必需的负调控区(NRR)。此外，本文所述的新受体掺入了胞外寡聚化结构域以促进所述嵌合受体的寡聚体形成。还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码所述受体的核酸、用所述核酸遗传修饰的工程化细胞、以及用于调节细胞的活性和/或用于治疗各种疾病如癌症的方法。病如癌症的方法。病如癌症的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有铰链结构域的人源化Notch受体
关于联邦政府资助研发的声明
[0001]本专利技术是在由美国国立卫生研究院授予的授权号OD025751下在美国政府支持下完成的。美国政府享有本专利技术的某些权利。相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年4月9日提交的美国临时专利申请序列号63/007,807；以及2021年3月24日提交的美国临时专利申请序列号63/165,588的优先权。将以上引用的申请的内容通过引用以其整体(包括任何附图)明确地并入本文。序列表的并入
[0003]本申请含有序列表，所述序列表通过引用以其整体特此并入。所附的名称为“Sequence Listing_048536
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678001WO.txt”的序列表文本文件创建于2021年4月1日，并且为138KB。


[0004]本公开文本总体上涉及结合细胞表面配体并且具有可选择的特异性和活性的新合成细胞受体。本公开文本还提供了可用于产生此类受体的组合物和方法、编码此类受体的核酸、用所述核酸遗传修饰的宿主细胞、以及用于调节基因表达、调节细胞的活性和/或用于治疗各种健康病症或疾病如癌症的方法。

技术介绍

[0005]基因工程化和合成生物学的最新进展使新型基因疗法和工程化细胞疗法的发展可用于治疗许多疾病和健康障碍。例如，许多第一代合成治疗系统(包括Notch受体的合成衍生物，其通常被称为“SynNotch受体”)由于其在治疗各种类型的恶性肿瘤中的相当大的潜力而在近年来获得了显著的关注。这些第一代SynNotch受体含有具有用户定义的特异性的野生型Notch受体的结构修饰、将胞外配体结合结构域(在野生型Notch中含有多个EGF样重复序列)用抗体衍生物代替、以及将胞质结构域用选择的转录激活物代替，与此同时仍然依赖于Notch负调控区(NRR)的功能(KT Roybal等人,Cell 2016年10月6日；167(2):419
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32)和L.Morsut等人,Cell(2016)164:780
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91)。
[0006]然而，在人中的第一代SynNotch受体疗法的发展对于临床开发仍存在重大挑战。第一代工程化SynNotch受体疗法的一个主要潜在的副作用是工程化SynNotch受体产物诱导宿主免疫应答的能力。免疫原性风险因素可以与工程化SynNotch受体中非人或部分人序列的存在相关以及与用作第一代工程化SynNotch受体产生的一部分的残余病毒蛋白或其他非人起源蛋白的存在相关。这些类型的免疫应答有可能驱动SynNotch介导的细胞疗法的免疫排斥，例如可能影响工程化细胞的扩增和持久性，从而影响治疗的整体安全性和临床上有意义的反应。
[0007]此外，第一代工程化SynNotch受体很大，并且接近传统慢病毒递送方案的包装限制，从而妨碍递送和添加其他有用分子组分的便利性。例如，Notch负调控区(NRR)跨越大约
160个氨基酸，使得仅此结构域就具有一些成熟蛋白质如胰岛素或表皮生长因子(EGF)的大小。这被认为会降低第一代SynNotch受体表达的效率，并且由于与载体能力相关的大小限制，因此排除了一些克隆和转染载体的使用。

技术实现思路

[0008]本公开文本总体上涉及一种含有人源化转录效应子的新类型的嵌合可寡聚化Notch受体，其被工程化以配体依赖性方式调节基因表达和细胞活性。这些完全人源化Notch受体的活性可以通过胞外配体的存在来控制，从而允许在空间和时间上控制哺乳动物细胞中特定基因表达，以及用于调节细胞活性或治疗各种健康病症或疾病。特别地，本文提供了完全人源化Notch受体，其令人惊讶地保留了响应于配体结合而转导信号的能力，尽管完全不存在包括负调控区(NRR)的Notch胞外亚基(NEC)。更特别地，这些受体掺入了胞外寡聚化结构域以促进所述嵌合受体的寡聚体形式(例如二聚体或三聚体形式)的形成。不受任何特定理论的束缚，此设计有助于受体的寡聚化或聚集，这改善了配体激活的转录调节。此外，这些受体提供了一系列的敏感性。另外，通过完全省略天然Notch NRR，可以使编码本公开文本的受体的多核苷酸小于编码第一代SynNotch的多核苷酸，这使得能够使用具有更有限容量的载体并且有助于包含另外的元件，所述另外的元件原本由于载体容量相关的大小限制而被排除。
[0009]因此，本文所述的新型嵌合合成Notch受体(称为“人源化铰链Notch受体”)大小紧凑，并且由于它们是完全人源化的，因此更适合临床细胞制造方案以及在人体中使用。
[0010]在一方面，本文提供了嵌合多核苷酸，所述嵌合多核苷酸从N末端到C末端包含：(a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域(ECD)；(b)能够促进经由分子间二硫键键合实现所述嵌合多肽的寡聚体形成的铰链结构域；(c)含有一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域(TMD)；以及(d)含有人或人源化转录效应子的胞内结构域(ICD)，其中所述选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合导致位于所述转录效应子与所述铰链结构域之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中所述嵌合多肽不包含Notch受体的LIN
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Notch重复序列(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。
[0011]根据本公开文本的嵌合多肽的非限制性示例性实施方案包括以下特征中的一个或多个。在一些实施方案中，所述跨膜结构域进一步包含停止转移序列。在一些实施方案中，所述胞外结构域包含能够结合至细胞表面上的配体的抗原结合部分。在一些实施方案中，所述细胞是病原体。在一些实施方案中，所述人细胞是肿瘤细胞。在一些实施方案中，所述人细胞是终末分化细胞。
[0012]在一些实施方案中，本文公开的嵌合多核苷酸包含胞外配体结合结构域，所述胞外配体结合结构域具有对选定的配体的结合亲和力，所述选定的配体包括蛋白质或碳水化合物。在一些实施方案中，所述配体是分化簇(CD)标记物。在一些实施方案中，所述CD标记物选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD
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L2)、CD274(PD
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L1)、CD276(B7H3)、
CD279、CD295、CD339(JAG1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种嵌合多肽，所述嵌合多肽从N末端到C末端包含：a)对选定的配体具有结合亲和力的胞外配体结合结构域；b)能够促进经由分子间二硫键键合实现所述嵌合多肽的寡聚体形成的铰链结构域；c)包含一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点的跨膜结构域；以及d)包含人或人源化转录效应子的胞内结构域，其中所述选定的配体与所述胞外配体结合结构域的结合导致在所述转录效应子与所述铰链结构域之间的配体诱导型蛋白水解切割位点处的切割，并且其中所述嵌合多肽不包含Notch受体的LIN
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Notch重复序列(LNR)和/或异二聚化结构域(HD)。2.根据权利要求1所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域进一步包含停止转移序列。3.根据权利要求1至2中任一项所述的嵌合多肽，其中所述胞外结构域包含能够结合至细胞表面上的配体的抗原结合部分。4.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述细胞是病原体。5.根据权利要求3所述的嵌合多肽，其中所述细胞是人细胞。6.根据权利要求5所述的嵌合多肽，其中所述人细胞是肿瘤细胞。7.根据权利要求5所述的嵌合多肽，其中所述人细胞是终末分化细胞。8.根据权利要求1至7中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体包括蛋白质或碳水化合物。9.根据权利要求1至8中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体选自CD1、CD1a、CD1b、CD1c、CD1d、CD1e、CD2、CD3d、CD3e、CD3g、CD4、CD5、CD7、CD8a、CD8b、CD19、CD20、CD21、CD22、CD23、CD25、CD27、CD28、CD33、CD34、CD40、CD45、CD48、CD52、CD59、CD66、CD70、CD71、CD72、CD73、CD79A、CD79B、CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD94、CD95、CD134、CD140(PDGFR4)、CD152、CD154、CD158、CD178、CD181(CXCR1)、CD182(CXCR2)、CD183(CXCR3)、CD210、CD246、CD252、CD253、CD261、CD262、CD273(PD
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L2)、CD274(PD
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L1)、CD276(B7H3)、CD279、CD295、CD339(JAG1)、CD340(HER2)、EGFR、FGFR2、CEA、AFP、CA125、MUC
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1、MAGE、胎盘碱性磷酸酶样蛋白2(ALPPL2)、B细胞成熟抗原(BCMA)、绿色荧光蛋白(GFP)、增强型绿色荧光蛋白(EGFP)以及信号调节蛋白α(SIRPα)。10.根据权利要求1至9中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体选自细胞表面受体、粘附蛋白、整合素、粘蛋白、凝集素、肿瘤相关抗原以及肿瘤特异性抗原。11.根据权利要求1至10中任一项所述的嵌合多肽，其中所述配体是肿瘤相关抗原或肿瘤特异性抗原。12.根据权利要求1至11中任一项所述的嵌合多肽，其中所述胞外配体结合结构域包含受体的配体结合部分。13.根据权利要求3至12中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分选自抗体、纳米抗体、双抗体、三抗体、微型抗体、F(ab')2片段、F(ab)v片段、单链可变片段(scFv)、单结构域抗体(sdAb)及其功能片段。14.根据权利要求13所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分包含scFv。15.根据权利要求3至14中任一项所述的嵌合多肽，其中所述抗原结合部分特异性地结合至选自以下的肿瘤相关抗原：CD19、B7H3(CD276)、BCMA(CD269)、ALPPL2、CD123、CD171、
CD179a、CD20、CD213A2、CD22、CD24、CD246、CD272、CD30、CD33、CD38、CD44v6、CD46、CD71、CD97、CEA、CLDN6、CLECL1、CS
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1、EGFR、EGFRvIII、ELF2M、EpCAM、EphA2、肝配蛋白B2、FAP、FLT3、GD2、GD3、GM3、GPRC5D、HER2(ERBB2/neu)、IGLL1、IL
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11Rα、KIT(CD117)、MUC1、NCAM、PAP、PDGFR
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β、PRSS21、PSCA、PSMA、ROR1、SIRPα、SSEA
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4、TAG72、TEM1/CD248、TEM7R、TSHR、VEGFR2、ALPI、瓜氨酸化波形蛋白、cMet以及Axl。16.根据权利要求15所述的嵌合多肽，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、BCMA、CEA、HER2、MUC1、CD20、ALPPL2、SIRPα或EGFR。17.根据权利要求16所述的嵌合多肽，其中所述肿瘤相关抗原是CD19、BCMA、HER2或ALPPL2。18.根据权利要求1至17中任一项所述的嵌合多肽，其中所述一个或多个配体诱导型蛋白水解切割位点包含γ分泌酶切割位点。19.根据权利要求1至18中任一项所述的嵌合多肽，其中所述转录效应子包含转录激活物或转录阻遏物。20.根据权利要求1至19中任一项所述的嵌合多肽，其中所述胞内结构域包含核定位序列。21.根据权利要求1至20中任一项所述的嵌合多肽，其中所述转录效应子包含：(i)DNA结合结构域和(ii)效应子结构域，所述转录效应子通过所述效应子结构域发挥其作用。22.根据权利要求21所述的嵌合多肽，其中所述DNA结合结构域与所述效应子结构域是N末端连接的。23.根据权利要求21所述的嵌合多肽，其中所述DNA结合结构域与所述效应子结构域是C末端连接的。24.根据权利要求21至23中任一项所述的嵌合多肽，其中所述DNA结合结构域源自人肝细胞核因子1同源盒A(HNF1α)蛋白、人肝细胞核因子1同源盒B(HNF1β)蛋白、人配对盒蛋白(Pax
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6)、人配对盒蛋白(Pax
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1)蛋白、人配对盒蛋白(Pax
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2)蛋白、人配对盒蛋白(Pax
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3)蛋白、人配对盒蛋白(Pax
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4)或人配对盒蛋白(Pax
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7)。25.根据权利要求24所述的嵌合多肽，其中所述DNA结合结构域源自人肝细胞核因子1同源盒A(HNF1α)蛋白。26.根据权利要求25所述的嵌合多肽，其中所述HNF1αDNA结合结构域包含SEQ IDNO:52的氨基酸序列或其功能变体。27.根据权利要求24所述的嵌合多肽，其中所述DNA结合结构域源自人配对盒蛋白(Pax6)。28.根据权利要求27所述的嵌合多肽，其中所述Pax6 DNA结合结构域包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或其功能变体。29.根据权利要求21至28中任一项所述的嵌合多肽，其中所述效应子结构域选自转录激活结构域、转录阻遏结构域和表观遗传效应子结构域。30.根据权利要求29所述的嵌合多肽，其中所述转录激活结构域源自人核因子NFκBp65亚基(p65)。31.根据权利要求30所述的嵌合多肽，其中所述转录激活结构域源自人核因子NFκBp65亚基(p65)。
32.根据权利要求31所述的嵌合多肽，其中所述p65效应子结构域包含SEQ ID NO:54
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55中的任一个的氨基酸序列或其功能变体。33.根据权利要求1至32中任一项所述的嵌合多肽，所述嵌合多肽进一步包含另外的蛋白水解切割位点、信号序列、可检测标记、肿瘤特异性切割位点、疾病特异性切割位点及其组合。34.根据权利要求1至33中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域源自CD8α铰链结构域、CD28铰链结构域、CD152铰链结构域、PD
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1铰链结构域、CTLA4铰链结构域、OX40铰链结构域、IgG1铰链结构域、IgG2铰链结构域、IgG3铰链结构域和IgG4铰链结构域或其任一种的功能变体。35.根据权利要求1至34中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域源自CD8α铰链结构域或其功能变体。36.根据权利要求1至34中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域源自CD28铰链结构域或其功能变体。37.根据权利要求1至34中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域源自OX40铰链结构域或其功能变体。38.根据权利要求1至34中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域源自IgG4铰链结构域或其功能变体。39.根据权利要求1至38中任一项所述的嵌合多肽，其中所述铰链结构域包含与SEQ IDNO:15
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19中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。40.根据权利要求1至39中任一项所述的嵌合多肽，其中所述停止转移序列包含与SEQ ID NO:31
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51中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。41.根据权利要求1至40中任一项所述的嵌合多肽，其中所述跨膜结构域包含与SEQ IDNO:21
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30中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。42.根据权利要求1至41中任一项所述的嵌合多肽，其中：a)所述铰链结构域包含与SEQ ID NO:15
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19中的任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列；b)所述跨膜结构域包含与SEQ ID NO:21
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30具有至少80％序列同一性的氨基酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：K，
申请(专利权)人：加利福尼亚大学董事会，
类型：发明
国别省市：