一种食品和乳品中叶酸的快速测定方法技术

本发明专利技术属于食品快速检测技术领域，具体涉及一种食品和乳品中叶酸的快速测定方法，包括以下步骤：S1.制备菌株储备液；S2.制备测定用平板；S3.制备标准溶液；S4.制备样液；S5.制备标准曲线及叶酸含量的测定。本发明专利技术采用杯碟法建立叶酸的快速测定方法，克服传统微生物法的检测缺陷，操作简单，效率高，成本低，重现性好，结果稳定，适用于大批量样品的检测需求。适用于大批量样品的检测需求。

【技术实现步骤摘要】
一种食品和乳品中叶酸的快速测定方法


[0001]本专利技术属于食品快速检测
，具体涉及一种食品和乳品中叶酸的快速测定方法。

技术介绍

[0002]目前，国内外关于叶酸的检测方法主要有：微生物法、高效液相色谱法、超高效液相色谱
ꢀ‑
串联质谱法、酶联免疫吸附法等。
[0003]相对于其他方法，微生物发具有较高的灵敏度，且可检测具有生物活性的叶酸。我国食品安全国家标准亦将微生物法作为叶酸的首选方法和仲裁方法。但现有的微生物法存在以下几点问题：1、在菌种使用方面，将干酪乳杆菌（Lactobacillus casei ATCC 7469 ）转接至琼脂培养基活化保存为储备菌株后，需每月传种一次。试验前需将储备菌株转接斜面培养24h重新活化，再使用种子培养液培养24h后，再转接至叶酸测定用培养基中培养6h制成接种液。试验过程容易造成菌株污染，且工作量大，时效性差。
[0004]该方法虽然将菌浓度和培养时间控制在一定范围内，但是由于不同代数的菌株活力不同，使用相同的菌浓度和培养时间不适用于不同代数菌株的生长。菌的生长规律也存在一定的偏差，无法有效的控制试验结果的稳定性。
[0005]2、样液的制备方面，样品需要经过多步灭菌、调pH值、稀释，分别加入0.5mL、1.0mL、2.0mL试样提取液至试管中,补水至5.0mL,加入5.0mL叶酸测定用培养液。
[0006]制备过程用到大量的玻璃器皿，对器皿清洗要求高。试验操作繁琐、耗时长，无法满足大批量样品的检测需求。并且试验过程容易出现人为误差，导致试验结果不稳定。
[0007]3、单个样品的培养需要用到至少45mL培养基，分装至9根玻璃试管。成本高，且需要足够的空间培养。
[0008]4、测定方面，现有方法需将培养液混匀后，转移至比色皿，使用分光光度计进行读数。每个样品需测量9个数据，且由于培养液中菌处于活动状态，因此容易造成数据不稳定，操作繁琐且测定时间长。
[0009]5、试验成本方面，以100个样计，现有方法以两名实验人员计算，耗时40天以上、耗材约1.5万元。
[0010]综上所述，现有微生物法检测叶酸存在操作繁琐、测定时间长、对人员要求较高，不易掌握，易污染、重现性差，无法满足大批量样品快速检测的需求等问题。
[0011]虽然中国专利CN201010277447.5公开了一种测定维生素H的生物学检测方法，通过维生素H浓度的对数值与生长圈直径的线性关系，建立一种快速简便检测维生素H含量的方法。但是，仍然存在以下问题：1、在进行试验前，需配置菌悬液，且菌悬液配置时间较长，一般为3天，检测效率低；2、采用的储备菌液，须反复活化传代，影响实验结果；
3、培养皿中培养基含量为25mL，培养基厚度大，不利于菌的生长扩散，且生长圈不易观察测量；同时采用的是覆盖法：培养基厚度大，透光性不强，模糊不易测量；4、培养时间为2天，时间较长。

技术实现思路

[0012]有鉴于此，本专利技术提供一种食品和乳品中叶酸的快速测定方法。
[0013]本专利技术的技术方案为：一种食品和乳品中叶酸的快速测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.制备菌株储备液；将冻干的营养缺陷型菌株接种到乳酸菌肉汤培养基上，34
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40℃培养20
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28 h；再转种3代增强活力；将活化后的菌液以8000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL无菌水，混匀；重复洗脱3次，确保无残留培养基；加入含甘油的叶酸测定用培养基，混匀制成菌株储备液，分装到菌株保存管中，
‑ꢀ
70℃冻存备用；S2.制备测定用平板；配制一定量的叶酸测定用培养基，加入琼脂粉后，121℃灭菌5min，冷却至50
‑
60℃，加入适量的菌株储备液，使培养基中菌浓度在设定的OD
600
值；充分混匀后，分装于无菌培养皿内；轻摇平板使菌液均匀平铺，待其凝固后制成测定用平板，2
‑
4℃保存备用；S3.制备标准溶液；S4.制备样液；S5.制备标准曲线及叶酸含量的测定；制备标准曲线：将无菌牛津杯放入叶酸测定用平板中，移取标准曲线溶液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于34
‑
40℃恒温培养箱中培养40
‑
48h；测量各溶液的菌株生长圈的直径；以叶酸标准品浓度的对数值为横坐标，生长圈直径为纵坐标，绘制标准曲线；叶酸含量的测定：移取样液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于34
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40℃恒温培养箱中培养40
‑
48h；测量各溶液的菌株生长圈的直径，然后根据标准曲线计算样品中叶酸的含量。
[0014]本专利技术是利用微生物的特异性，给予一定的营养条件或改变微生物的生存环境，通过其生长繁殖和代谢表达来完成对单一维生素成分的测定。虽然现有技术中微生物法已经非常成熟，利用微生物本身对生存环境极为敏感，且其特异性表达决定了微生物法检出限低、灵敏度高、结果可靠的优点，但同时也因为微生物易染菌、特异性强造成了其具有培养周期长、重现性差等缺点。尤其是活化培养及分离，不论传统方法或现代检测技术，受检测灵敏度的限制，经前处理后多需经过活化培养、选择性分离后方可用于后续检测分析。传统微生物检测中上述两个步骤耗时长达24
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96h，为整个检测流程中的关键限速步骤。
[0015]本专利技术中，通过将干酪乳杆菌的冻干菌株活化传代后，利用甘油将同一批次储备菌株分装冻存到菌株保存管中，可长时间保持菌株的活力，节省了菌种制备的时间，简化了实验操作，有效降低了污染的概率；并且，由于同一批次分装的菌株活力基本一致，制备平板时无须重复测定。有效控制试验菌株的活力，保证了试验的稳定性，简化了实验操作，避免交叉污染。另外，制备的平板相当于特异性检测试剂盒，保存时间长，试验前现取现用，节省了检验时间，有效提高了检测效率解决了传统微生物法试验周期长、操作复杂的问题，极
大缩短了检测时间。
[0016]进一步的，步骤S1中，所述营养缺陷型菌株为干酪乳杆菌。本专利技术中，叶酸是干酪乳杆菌生长所必须的营养素，根据分子扩散的原理，利用杯碟法使叶酸在含干酪乳杆菌的特异性培养基内呈球面形扩散，形成含一定浓度叶酸的球形区。干酪乳杆菌在无叶酸的培养基区域无法生长繁殖，在含叶酸的培养基区域生长繁殖而呈现浑浊的生长圈。在一定浓度范围内，干酪乳杆菌生长圈的大小与叶酸浓度呈线性关系。
[0017]进一步的，步骤S1中，加入含10
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30%甘油的叶酸测定用培养基。
[0018]本专利技术中，通过添加10
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30%甘油，利用甘油保护菌种，节省菌种制备时间，简化试验操作，同时菌种活力更稳定，保证了试验的有效性。
[0019]进一步的，步骤S2中，所述菌株储备液于加入琼脂粉后的叶酸测定用培养基中的浓度为0.5%
‑
2%。
[0020]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种食品和乳品中叶酸的快速测定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1.制备菌株储备液；将冻干的营养缺陷型菌株接种到乳酸菌肉汤培养基上，34
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40℃培养20
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28 h；再转种3代增强活力；将活化后的菌液以8000 r/min离心5 min，弃去上清液，加入10 mL无菌水，混匀；重复洗脱3次，确保无残留培养基；加入含甘油的叶酸测定用培养基，混匀制成菌株储备液，分装到菌株保存管中，
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70℃冻存备用；S2.制备测定用平板；配制一定量的叶酸测定用培养基，加入琼脂粉后，121℃灭菌5min，冷却至50
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60℃，加入适量的菌株储备液，使培养基中菌浓度在设定的OD600值；充分混匀后，分装于无菌培养皿内；轻摇平板使菌液均匀平铺，待其凝固后制成测定用平板，2
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4℃保存备用，试验时按量取用；S3.制备标准溶液；S4.制备样液；S5.制备标准曲线及叶酸含量的测定；制备标准曲线：将无菌牛津杯放入叶酸测定用平板中，移取标准曲线溶液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于34
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40℃恒温培养箱中培养40
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48h；测量各溶液的菌株生长圈的直径；以叶酸标准品浓度的对数值为横坐标，生长圈直径为纵坐标，绘制标准曲线；叶酸含量的测定：移取样液于各牛津杯中，无菌蒸馏水空白对照组，一式3份；将平板正置于34
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40℃恒温培养箱中培养40
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48h；测量各溶液的菌株生长圈的直径，然后根据标准曲线计算样品中叶酸的含量。2.根据权利要求1所述的食品和乳品中叶酸的快速测定方法，其特...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄翠莉，严家俊，刘辉，郑思珩，綦艳，吴思敏，张娟，金佳佳，庄艺协，苏焕斌，
申请(专利权)人：广东产品质量监督检验研究院国家质量技术监督局广州电气安全检验所，广东省试验认证研究院，华安实验室，
类型：发明
国别省市：