一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法技术

本发明专利技术公开一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法。冻存液包括聚蔗糖1

【技术实现步骤摘要】
一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法


[0001]本专利技术涉及免疫细胞的保存，特别涉及一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法。

技术介绍

[0002]恶性肿瘤一直是人类挥之不去的疾病之一，是机体正常细胞恶变的产物,具有不断增殖并有可能在体内转移的特点。为了生存和生长，肿瘤细胞能够采用不同策略抑制人体的免疫系统,使其不能正常地杀伤肿瘤细胞，从而在抗肿瘤免疫应答的各阶段得以幸存。
[0003]目前治疗肿瘤传统方式主要包括手术、化疗、放疗为主，辅以内分泌、中药等，但均存在较严重并发症和副作用。
[0004]近年来，随着人类基因组和癌症基因组计划的顺利实施，免疫细胞疗法得到了突飞猛进的发展。
[0005]其中，NK细胞是人体重要的免疫细胞之一。NK细胞一旦发现了癌细胞、细菌、病毒的踪迹，即可在5分钟以内将其消灭，高效密集保卫着我们的身体不受侵害。NK细胞免疫疗法是通过向肿瘤患者输注在体外培养扩增或激活后，具有抗肿瘤活性的免疫细胞，直接杀伤或激发机体免疫反应杀伤肿瘤细胞，达到目的。
[0006]又如，CIK细胞主要用于自体骨髓移植物的净化、微小残留病灶的清除及晚期恶性肿瘤(包括急慢性血液系统恶性疾病和各种实体瘤)的免疫治疗，副作用轻微，患者耐受较好。因此，CIK细胞免疫治疗值得我们进一步开展更为详细而深入的研究。
[0007]2017年CAR
‑
T细胞免疫治疗首次获批，用于晚期的肿瘤治疗。2021年，中国首个CAR
‑
T细胞面世，免疫细胞用于治疗各种疾病的技术已经发展得越来越成熟。
[0008]在免疫细胞的临床使用中，往往因为细胞质量检测、运输、患者病情不稳定等因素，导致细胞不能及时回输，此时就需要临时保存于液氮中，待需要时再取出应用。实验室常见的冻存方式一般是添加异种来源血清，和目前市售的无血清冻存液。但添加异种血清会存在一定的风险，再者目前这两种方式在高密度冻存后细胞活性很难保障，所以在本
里，当前还缺乏一种免疫细胞成品细胞的高密度冻存，以确保在小体积冻存下方便操作，成本较低，不占宝贵的低温空间，同时保证细胞活性的方式。

技术实现思路

[0009]针对现有技术存在的免疫细胞高密度冻存后活性很难保障的技术问题，本专利技术提供一种成品免疫细胞的冻存液及其制备方法和冻存方法，用于免疫细胞的高密度冻存，冻存后能够保持高活性。
[0010]本专利技术成品免疫细胞的冻存液，组成如下：聚蔗糖1
‑
3.7wt％，羟甲基壳聚糖1
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2wt％，人血白蛋白5
‑
15wt％，泛影葡胺1
‑
9wt％，二甲基亚砜(DMSO)5
‑
10v/v％，控制乙二胺四乙酸三钾(EDTAK3.H2O)在冻存液中的浓度为1.2
‑
2.5mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮(PVP K30)在冻存液中的浓度为10
‑
50mg/ml，其中wt％表示质量百分比，v/v％表示体积百分比，采用磷
酸盐缓冲液(PBS)配制。
[0011]上述成品免疫细胞的冻存液的制备方法，包括如下步骤：
[0012]首先确定需要配置的冻存液体积，采用磷酸盐缓冲液(PBS)配制乙二胺四乙酸三钾(EDTAK3.H2O)、聚蔗糖、羟甲基壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、人血白蛋白、泛影葡胺，然后混合均匀，最后滴加二甲基亚砜(DMSO)混合均匀，并控制各组分的质量百分比、体积百分比或浓度满足上述组成的。
[0013]采用上述冻存液冻存成品免疫细胞的方法，包括如下步骤：
[0014]1，取培养好并检测合格的免疫细胞原液离心8
‑
15分钟，去上清；
[0015]2，将步骤1所得细胞沉淀用缓冲溶液重悬(重悬要确保轻柔)；
[0016]3，将步骤2所得细胞悬液用细胞筛过滤，离心8
‑
15分钟，去上清；
[0017]4，用定量的缓冲溶液重悬步骤3所得细胞(重悬要确保轻柔)，取样计数，计活率；
[0018]5，分出所需数量的细胞悬液分装配平，离心8
‑
15分钟，去上清(用无菌吸水纸吸净液体)；
[0019]6，采用预冷的上述冻存液将细胞重悬(重悬要确保轻柔)，控制终体积为所需的冻存体积，将悬液转移到冻存容器中，整个过程动作轻柔，液体尽可能吸干净；
[0020]7，将冻存容器放入
‑
80℃保存10
‑
16小时后转存至液氮中保存，此降温环节相比程序降温更快速便捷。
[0021]上述冻存方法中，多处涉及去上清，去上清时，因为细胞数量多，容易残留较多液体或者损失较多细胞，因此在去上清时，优选将液体倒出，但保持细胞沉淀不动，残余液体用医用无菌吸水纸小心吸出，通过无菌吸水纸吸水，从而能够减少液体残留，降低对后续步骤中冻存液的稀释。
[0022]采用上述方法对成品免疫细胞进行冻存后，复苏方法如下：
[0023](1)从液氮中取出细胞，35
‑
40℃水浴中快速融化；
[0024](2)准备两只50ml离心管，分别加入5
‑
20ml完全培养基，将细胞悬液平均转移到两只50ml的离心管中，用缓冲液清洗冻存容器至少3次，并将液体一并转移到离心管中；
[0025](3)将两支离心管分别定容至50ml，吹吸液体(吹吸要确保轻柔)，使得原保存液与缓冲液充分互溶，降低整体比重，离心5
‑
15分钟，去上清；
[0026](4)再次加入缓冲液，并向每支离心管加入1
‑
10ml质量分数为15
‑
20％的人血白蛋白，重悬步骤(3)所得细胞(重悬要确保轻柔)，每支离心管补齐50ml，混匀细胞后离心8
‑
15分钟，去上清；
[0027](5)将步骤(4)所得细胞重悬液转移至一支50ml离心管中，加入1
‑
10ml质量分数为20％的人血白蛋白，重悬细胞(重悬要确保轻柔)，离心管补齐50ml，混匀细胞后离心8
‑
15分钟，去上清；
[0028](6)向步骤(5)所得细胞中加入1
‑
10ml质量分数为20％的人血白蛋白并用缓冲液重悬细胞，取样计数及活率。
[0029]以上步骤中添加的人血白蛋白，能够有效提升复苏细胞的活性以及细胞收获数量。
[0030]与现有技术相比，本专利技术的有益效果在于：
[0031](1)本专利技术的冻存液各组分互相配合，共同发挥作用，EDTAK3.H2O能有效结合残留
的Ca
2+
离子，使细胞与细胞间不能形成有效连接，使得细胞始终保持单个状态；羟甲基壳聚糖与PVP K30都具有非常强的生物相容性，同时与聚蔗糖、泛影葡胺共同组成多元溶解物，使得整个保存液处于一个比重与成品免疫细胞相似的微胶状态，与配置时使用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种成品免疫细胞的冻存液，其特征在于，组成如下：聚蔗糖1
‑
3.7wt％，羟甲基壳聚糖1
‑
2wt％，人血白蛋白5
‑
15wt％，泛影葡胺1
‑
9wt％，二甲基亚砜5
‑
10v/v％，乙二胺四乙酸三钾EDTAK3.H2O在冻存液中的浓度为1.2
‑
2.5mg/ml，聚乙烯吡咯烷酮K30在冻存液中的浓度为10
‑
50mg/ml，其中wt％表示质量百分比，v/v％表示体积百分比，采用磷酸盐缓冲液配制。2.权利要求1所述的成品免疫细胞的冻存液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：首先确定需要配置的冻存液体积，采用磷酸盐缓冲液配制乙二胺四乙酸三钾、聚蔗糖、羟甲基壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮K30、人血白蛋白、泛影葡胺，然后混合均匀，最后滴加二甲基亚砜DMSO混合均匀，并控制各组分的质量百分比、体积百分比或浓度满足权利要求1所述的组成要求。3.一种成品免疫细胞的冻存方法，其特征在于，包括如下步骤：1，取培养好并检测合格的免疫细胞原液离心8
‑
15分钟，去上清；2，将步骤1所得细胞沉淀用缓冲溶液重悬；3，将步骤2所得细胞悬液用细胞筛过滤，离心8
‑
15分钟，去上清；4，用定量的缓冲溶液重悬步骤3所得细胞，取样计数，计活率；5，分出所需数量的细胞悬液分装配平，离心8
‑
15分钟，去上清；6，采用预冷的权利要求1所述的冻存液将细胞重悬，将悬液转移...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵朝伟，张舒乐，黄青，吴定，石慧娟，李海，李鸿颖，
申请(专利权)人：湖南开启时代科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：