一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法技术

本发明专利技术公开了一种以桫椤孢子萌发诱导绿色球状体（Green Globular Bodies，GGB）途径组培快繁的方法，该方法包括桫椤无菌孢子的获取、桫椤孢子诱导配子体、桫椤GGB诱导增殖、桫椤GGB分化、桫椤孢子体生根、桫椤再生植株驯化、练苗和移栽。本发明专利技术中GGB的诱导率100%、GGB分化率92%、生根率100%、桫椤再生植株成活率100%。本发明专利技术技术与传统播种繁殖相比，具有萌发率高、繁殖周期短和成活率高等特点。此发明专利技术实现了濒危物种桫椤的组培快繁；对我国珍稀植物桫椤种质资源扩繁、离体保存、濒危程度的缓解、维持种群生态平衡以及其野生资源可持续发展利用具有重要意义。展利用具有重要意义。展利用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法


[0001]本专利技术属蕨类植物组织培养领域，具体涉及桫椤无菌孢子的获取、桫椤孢子诱导配子体、桫椤GGB诱导增殖、桫椤GGB分化、孢子体生根、桫椤组培苗移栽；旨在获得大量的桫椤再生植株，以解决桫椤自然萌发率低和种质资源不足问题。

技术介绍

[0002]桫椤（Alsophila spinulosa (Wall. ex Hook.) R. M. Tryon），属桫椤科（Cyatheaceae）、桫椤属（Alsophila），是现存唯一的木本蕨类植物，老蕨类家族的后裔，界于低等与高等植物之间。桫椤主要分布于温暖潮湿的热带及亚热带地区，我国主要分布于贵州、重庆、四川等多个省地。桫椤在《国家重点保护野生植物名录》中被列为国家二级保护植物，在《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录中被列为附录Ⅱ物种。桫椤具有观赏、药用以及学术等多方面的价值，比如桫椤树形高雅飘逸、青翠碧绿，直立的树状茎和排列整齐的孢子囊群是自然界的一大奇观；在药用价值上，它的茎、叶片富含黄酮、萜类、酚类、有机酸等药用物质；而学术价值上，桫椤对生长环境的特别性，在一定程度上能做指示植物。桫椤还具有古老性与孑遗性，这对研究植物系统发育和生物进化具有深刻意义。桫椤遗传的多样性、生态位的局限、生境的消减以及害虫的取食，使其逐渐致频。因此探究适合桫椤高效的繁殖方法迫在眉睫。
[0003]桫椤的孢子繁殖周期长，其配子体时期的精子器与颈卵器需水作为媒介才能受精成功，故自然条件下受精困难，难以形成孢子体。虽然桫椤孢子产出量大，但在实际野外调查发现土壤表层桫椤幼苗极少。植物组织培养技术作为一种高效的无性繁殖方法，具有繁殖周期短，繁殖效率高和不受季节限制等特点。因此借助组织培养技术来探究桫椤发育历程、繁衍桫椤是目前最直接、最简便、最有效的方法。
[0004]绿色球状体途径是蕨类植物特有的繁殖途径，由外植体诱导增殖得到的由众多绿色颗粒组成的GGB。同样地，桫椤孢子在适宜培养条件下，其诱导的配子体经生长、发育和不断增殖形成GGB，通过此途径进一步分化诱导成再生植株，其繁殖效率高于野外孢子繁殖及人工土培繁殖，具有分化快、成苗周期短等优点。桫椤通过组培快繁方面的文章极少，未见珍稀濒危蕨类植物桫椤通过GGB途径组培扩繁研究的相关报道。运用组培技术成功构建桫椤GGB繁殖体系，对珍稀濒危植物桫椤的种群数量扩大，缓解濒危程度具有重大的意义。
[0005]目前，经过检索发现现有专利中对桫椤的组织培养的相关专利如下：现有专利1（CN115029294A）公开了一种桫椤孢子无菌繁殖的方法，跟本专利技术的区别在于运用组培方法路径不同，孢子的培养、增值、诱导方法均不同；现有专利2（CN110432154A）公开了一种桫椤组织的培养方法，与本专利技术的培养方法不同、诱导路径不同、外植体的处理方法不同；现有专利3（CN110432154A）公开了一种中华桫椤绿色球状体途径的组培方法，与本专利技术区别在于虽然两种桫椤都属桫椤科、桫椤属，但不是一个物种，具有一定的差异，两者的诱导GGB材料不同，因此诱导出的绿色球状体不同，并且诱导和分化的方法不同。本专利技术研究通过GGB途径来扩繁桫椤，使其GGB诱导率100%，GGB分化率92%，生根率、移栽成活率都为100%，为产
业化生产桫椤增添技术支持。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于，提供一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法。本专利技术通过GGB途径来扩繁桫椤。其诱导率、分化率、生根率、移栽成活率高，克服了桫椤的繁衍能力低，种群数量低，通过孢子繁殖途径周期长、效率低等技术问题。
[0007]本专利技术的技术方案：一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，所述方法是先获取桫椤无菌孢子，将桫椤无菌孢子诱导成配子体，再进行桫椤GGB的诱导增殖、桫椤GGB分化诱导、桫椤孢子体生根诱导、桫椤再生植株驯化练苗和移栽。
[0008]前述的桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，所述方法包括以下步骤：（1）桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入蒸馏水浸泡，离心，移液枪去除上清液，在超净工作台上用75%酒精消毒，待孢子上下分层，去除上清液，用灭菌后的蒸馏水清洗，再用4% NaClO溶液消毒，摇晃离心管后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗，最后加入无菌水，制成A品；（2）桫椤孢子诱导配子体：将A品接种于诱导配子体培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 Lux的培养条件下，培养2个月，得到B品；（3）桫椤GGB的诱导增殖：将B品切割成4
×
4mm的方块，接种的配子体的初始鲜重0.08
‑
0.12g，接种在诱导增殖GGB培养基上，在温度25
±
2℃、湿度80
±
2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 Lux的培养条件下，培养2个月，得到C品；（4）桫椤GGB分化诱导：将C品每隔15天，喷洒一次无菌水，促进C品受精，继续培养30天后，将C品分割为直径的1
ꢀ‑
1.5 cm的小球，接种到GGB分化诱导培养基中, 在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 Lux的培养条件下，培养2个月后，得到D品；（5）桫椤孢子体生根诱导：取D品转接至生根诱导培养基诱导其生根，在温度25
±
2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 Lux的培养条件下，培养1个月，得到E品；（6）桫椤再生植株驯化、炼苗和移栽：选取苗高达到5
‑
10 cm的E品在人工气候室驯化、练苗后移栽至不同的基质中，在温度25
±
2℃，湿度89
±
2%，光质为白光，光周期16 h/d，培养1个月移栽到大棚进行常态化管理。
[0009]前述步骤（1）中，桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入50 mL的蒸馏水浸泡12 h，4500 r/min条件下离心机离心4 min，移液枪去除上清液，在超净工作台上用40
‑
50 mL的75%酒精消毒30 s，静置90s，待孢子上下分层，去除上清液，用无菌水清洗3次，再用40
‑
50mL的4% NaClO溶液消毒，摇晃离心管4 min后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗7
‑
8次，再加入20
‑
30 mL无菌水，制成A品。
[0010]前述步骤（2）中，诱导配子体培养基是由1/8MS+0.5mg/L的6
‑
BA+0.1mg/L的2,4
‑
D+20g/L蔗糖+16 g/L琼脂组成，再使用1 mol/L NaoH和1 mol/L HCl调至pH为5.80。
[0011]具体的说，前述步骤（2）中，1/8MS是由0.125份大量元素、1份铁盐、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，其特征在于：所述方法是先获取桫椤无菌孢子，将桫椤无菌孢子诱导成配子体，再进行桫椤GGB的诱导增殖、桫椤GGB分化诱导、桫椤孢子体生根诱导、桫椤再生植株驯化练苗和移栽。2.根据权利要求1所述的桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：（1）桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入蒸馏水浸泡，离心，移液枪去除上清液，在超净工作台上用75%酒精消毒，待孢子上下分层，去除上清液，用灭菌后的蒸馏水清洗，再用4% NaClO溶液消毒，摇晃离心管后静置分层，去除上清液，用无菌水清洗，最后加入无菌水，制成A品；（2）桫椤孢子诱导配子体：将A品接种于诱导配子体培养基上，在温度25
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2℃、湿度80
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2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 Lux的培养条件下，培养2个月，得到B品；（3）桫椤GGB的诱导增殖：将B品切割成4
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4mm的方块，接种的配子体的初始鲜重0.08
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0.12g，接种在诱导增殖GGB培养基上，在温度25
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2℃、湿度80
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2%、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 Lux的培养条件下，培养2个月，得到C品；（4）桫椤GGB分化诱导：将C品每隔15天，喷洒一次无菌水，促进C品受精，继续培养30天后，将C品分割为直径的1
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1.5 cm的小球，接种到GGB分化诱导培养基中, 在温度25
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2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 Lux的培养条件下，培养2个月后，得到D品；（5）桫椤孢子体生根诱导：取D品转接至生根诱导培养基诱导其生根，在温度25
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2℃、光质为白光、光周期12 h/d和光照强度为3000 Lux的培养条件下，培养1个月，得到E品；（6）桫椤再生植株驯化、炼苗和移栽：选取苗高达到5
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10 cm的E品在人工气候室驯化、练苗后移栽至不同的基质中，在温度25
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2℃，湿度89
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2%，光质为白光，光周期16 h/d，培养1个月移栽到大棚进行常态化管理。3.根据权利要求2所述的桫椤孢子诱导绿色球状体途径植物组织培养的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，桫椤无菌孢子获取：取成熟的桫椤孢子置于离心管中，加入50 mL的蒸馏水浸泡12 h，4500 r/min条件下离心机离心4 min，移液枪去除上清液，在超净工作台上用40
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50 mL的75%酒精消毒30 s，静置90s，待孢子上下分层，去除上清液，用无菌水清洗3次，再用40
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50mL的4% N...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨卫诚，杨姣，何琴琴，吴高殷，翁涛，彭涛，江昱，白小节，杨长容，车冰洁，
申请(专利权)人：赤水桫椤国家级自然保护区管理局，
类型：发明
国别省市：