滇龙胆多倍体培育方法技术

滇龙胆多倍体培育方法，涉及滇龙胆多倍体的培育技术。本发明专利技术的方法包括外植体的选择与清洁、外植体的消毒、接种、染色体加倍诱导、生根培养、形态鉴定筛选、染色体鉴定步骤；其中，诱导液为不添加琼脂的MS+0.04

【技术实现步骤摘要】
滇龙胆多倍体培育方法


[0001]本专利技术涉及中药材的育种方法，属于中药材及生物
，特别涉及滇龙胆多倍体的培育方法。

技术介绍

[0002]滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.）为龙胆科龙胆属多年生草本植物，以根和根茎，是我国常用大宗药材之一,具有清热燥湿、泻肝胆火的功效。滇龙胆主产于云南。
[0003]多倍体普遍存在于自然界中，常见于高等植物中，据资料统计，种子植物中的528属1171种中约有38.71%是多倍体，其中被子植物约50%为多倍体。
[0004]多倍体由于具有抗逆性增强、茎叶增粗增厚、可使单株生物量增加或次生代谢产物增加等特性，使得多倍体育种逐渐成为植物育种的重要方向。对于观赏性植物来说，多倍体可能使其更具观赏性，而对于药用植物来说，多倍体可能使其产量增加，亦有可能使其有效成分含量提高。
[0005]目前，仅有孙天国等发表的（《东北龙胆多倍体诱导的研究》[J]，高师理科学刊，2010，30（2）：69
‑
71）以及梁伟发表的（大叶秦艽的组织培养及离体诱导多倍体的研究[D]，西安：西北大学，2007。）对龙胆多倍体诱导进行了研究，但还未有滇龙胆多倍体育种的相关报道。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的是提出一种滇龙胆多倍体培育方法，使得培育出的滇龙胆更具观赏性，有效成分含量提高，亩产提高。
[0007]滇龙胆多倍体培育方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1，选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体，并进行清洁和消毒；步骤2，将消毒好的外植体接种于丛生芽诱导培养基中进行诱导；步骤3，将诱导出的丛生芽，置于诱导液中进行染色体加倍诱导；步骤4，将经染色体加倍诱导的芽，接种于生根培养基中生根培养；步骤5，生根培养后进行形态鉴定筛选，筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的生根苗；步骤6，染色体鉴定，取经筛选的苗的根尖，用染色体染色计数法镜检，筛选出染色体数至少等于4n的生根苗为滇龙胆多倍体；步骤3所述的诱导液为不添加琼脂的MS+0.04
‑
0.08%安磺灵+0.02
‑
0.05%二甲戊灵+0.5%DMSO。
[0008]步骤2所述的丛生芽诱导培养基为MS+NAA0.01
‑
0.05mg/L+KT 5.0
‑
10.0mg/L+TDZ 0.05
‑
0.15mg/L。
[0009]步骤4所述的生根培养基为1/2MS+NAA0.5
‑
1mg/L+IAA0.5
‑
1.0mg/L。
[0010]植物多倍体育种中常用的化学诱导剂为秋水仙素，但其为剧毒化学品，购买及使
用都极其严格，其药品的管理及使用有一定的安全风险，而本专利技术的化学诱导剂为二甲戊灵和安磺灵，均为低毒试剂，使用时相对秋水仙素安全，同时由于其主要用途为除草剂，更加容易采购，使用成本较低。
[0011]本专利技术染色体加倍诱导剂采用二甲戊灵和安磺灵进行复配使用，丛生芽死亡率低于8%，多倍体诱导率高达65%以上，较单一使用秋水仙素的丛生芽死亡率低，多倍体诱导率高。
[0012]本专利技术能使滇龙胆药材中核心质量标准的龙胆苦苷含量增加1.2倍左右。使滇龙胆茎明显增粗，叶明显增宽，可使得种植亩产提高约1.4倍以上。可使滇龙胆花色更具观赏价值，同时花期亦可延长15
‑
40天。
附图说明
[0013]图1为染色体加倍前后比较图，其中，图1a为染色体加倍后的形态学叶片增肥变宽，图1b为未进行染色体加倍的叶片形态，相对较薄及小。
[0014]图2为染色体加倍前后比较图，其中，图2a为染色体加倍后形态学明显增粗，图2b为为未进行染色体加倍的茎形态，相对较细。
[0015]图3为多倍体滇龙胆表现出的不同花色及花型。
具体实施方式
[0016]实施例1：滇龙胆多倍体培育方法，包括以下步骤：1、外植体的选择与清洁：选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体，用肥皂水涮洗至表面无明显尘土，自来水冲淋40min。
[0017]2、外植体的消毒：将清洁完成的外植体，转移至超净工作台内，用75%酒精消毒20s，无菌水冲洗2次，饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水冲洗3次，0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗6次，消毒污染率为17.4%，消毒死亡率为3.6%。
[0018]3、接种：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于MS+NAA0.01mg/L+KT 5.0mg/L+TDZ 0.05mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度为25
±
2℃，单日照强度为2000
‑
3000lx的白光12h进行光暗交替培养30天，丛生芽诱导率为65.9%。
[0019]4、染色体加倍诱导：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，置于MS（不添加琼脂）+0.04%安磺灵+0.02%二甲戊灵+0.5%DMSO（二甲基亚砜）的诱导液中，置于温度为25
±
2℃，单日照强度为2000
‑
3000lx的白光12h进行光暗交替下静置培养6天，多倍体诱导率为69.3%，诱导后芽死亡率为4.9%。
[0020]5、生根培养：将经染色体加倍诱导的芽，接种于1/2MS+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/L的生根培养基中，置于温度为25
±
2℃，单日照强度为2000
‑
3000lx的白光12h进行光暗交替下培养30天，生根率为100%。
[0021]6、形态鉴定筛选：
筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的生根苗，变异率为86.3%。
[0022]7、染色体鉴定：取经筛选的苗的根尖，用染色体染色计数法镜检，筛选出染色体数至少为4n的生根苗为滇龙胆多倍体，形态变异植株中多倍体率为80.3%。
[0023]实施例2：滇龙胆多倍体培育方法，包括以下步骤：1、外植体的选择与清洁：选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体，用肥皂水涮洗至表面无明显尘土，自来水冲淋50min。
[0024]2、外植体的消毒：将清洁完成的外植体，转移至超净工作台内，用75%酒精消毒20s，无菌水冲洗2次，饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水冲洗3次，0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗6次，消毒污染率为15.9%，消毒死亡率为3.8%。
[0025]3、接种：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于MS+NAA 0.05mg/L+KT 10.0mg/L+TDZ 0.15mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度为25
±
2℃，单日照强度为2000
‑
3000lx的白光12h进行光暗交替培养30天，丛生芽诱导率为69.1%。
[0026]4、染色体加倍诱导：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，置于MS（不添加琼脂）+0.08%安磺灵+0.05%二本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.滇龙胆多倍体培育方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1，选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体，并进行清洁和消毒；步骤2，将消毒好的外植体接种于丛生芽诱导培养基中进行诱导；步骤3，将诱导出的丛生芽，置于诱导液中进行染色体加倍诱导；步骤4，将经染色体加倍诱导的芽，接种于生根培养基中生根培养；步骤5，生根培养后进行形态鉴定筛选，筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的生根苗；步骤6，染色体鉴定，取经筛选的苗的根尖，用染色体染色计数法镜检，筛选出染色体数至少等于4n的生根苗为滇龙胆多倍体；步骤3所述的诱导液为不添加琼脂的MS+0.04
‑
0.08%安...

【专利技术属性】
技术研发人员：左应梅，张金渝，张霁，杨维泽，朱新焰，杨美权，何凤春，
申请(专利权)人：云县信合农业发展有限公司，
类型：发明
国别省市：