一种鉴定芹菜愈伤组织完全胚性化的方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法。包括：芹菜愈伤组织的准备、芹菜愈伤组织的染色、染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开；将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准、验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法等步骤。本发明专利技术公开的鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法，在体细胞诱变育种、遗传转化和植物组织脱毒培养方面都有良好的应用前景，并存在较强的技术优势。并存在较强的技术优势。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定芹菜愈伤组织完全胚性化的方法


[0001]本专利技术属于植物组织培养
，特别是一种涉及鉴别芹菜胚性愈伤组织完全胚性化的方法。

技术介绍

[0002]芹菜（Apium graveolens L.）作为我国常见的蔬菜之一，种植历史悠久、地区广泛。芹菜在我国种植历史悠久、地区分布广泛，并且芹菜富含维生素和纤维素，对人体有益，近年来，逐渐成为我国餐桌上常见的蔬菜之一。植物的体细胞胚发生指离体的植物细胞或组织在适当的诱导条件下，通过与合子胚相似的途径，经过球形胚、鱼雷胚、心形胚和子叶胚四个阶段，形成胚状体从而发育成完整植株。诱导体细胞胚发生能够极大地发挥植物细胞的分化潜力，具有较高的遗传稳定性。然而只有愈伤组织完全胚性化，才能进行体细胞胚发生诱导出胚状体进而再生出完整植株。传统的判断愈伤组织是否胚性化的依据是通过观察细胞的形态结构特征来判断，一般根据细胞核大小和细胞的形态特征，这些都是以描述性的语言进行判断，在实际操作中无法依照量化的标准执行，因此导致愈伤组织胚性化程度不够，再生的植株数量少，质量差，无法满足试验的要求。虽然可以根据愈伤组织再生的情况进行判断，但往往要反复试验多次，浪费大量的时间和成本，而本方法采用显微镜检技术，通过显微观察计算细胞分裂频度和核占比来鉴定别愈伤组织是否完全胚性化，从而使得操作者能够精确判定芹菜愈伤组织是否完全胚性化，提高了试验效率，为进一步利用芹菜胚性愈伤组织研究与应用奠定了基础。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供一种用显微镜检技术，通过观察计算细胞分裂频度及核占比来鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法。
[0004]为实现上述目的，本专利技术公开了如下的
技术实现思路
：一种鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）芹菜愈伤组织的准备：将诱导出的芹菜愈伤组织从培养中的器皿中取出，挑取1
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2mm的小块放到载玻片上，滴2
‑
3滴卡诺氏固定液进行固定，固定时间5
‑
10分钟；（2）芹菜愈伤组织的染色：用滤纸将放在载玻片上的愈伤组织周围的固定液吸干，滴1滴事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色。染色时间为10
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15分钟，染色温度为25
‑
28℃；所述的事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色。
[0005]其中卡宝品红配制方法：先配成三种原液,再配成染色液；原液A:3 g碱性品红溶于100 ml 70%酒精中；原液B:取原液A 10 ml加入到90 ml 5%石炭酸水溶液中；原液C:取原液B 55 ml,加入6 ml 冰醋酸和6 ml福尔马林(38%的甲醛)；染色液:取C液10—20 m1,加45%冰醋酸80～90 ml,再加山梨醇1.8 g,配成10%～20%浓度的石炭酸品红液,放置两周后使用,效果显著。
[0006]醋酸洋红配制方法：将洋红粉末1g倒入煮沸的100mL45%醋酸溶液中，边煮边搅拌，
时间不超过30s，快速冷却，加入1%～2%铁明矾水溶液5
‑
10滴，至此液变为暗红色而不发生沉淀为止，滤纸过滤，棕色瓶中室温保存备。
[0007]（3）染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开。将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；（4）鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准：在显微观察的视野下，以能够看清细胞的细胞核和细胞基本轮廓为前提，一般在放大200
‑
400倍的条件下进行观察计数。判断愈伤组织细胞完全胚性化的依据是分别选取不同视野下统计细胞的总数量在500
‑
1000个，当被统计的细胞中处于分裂期的细胞占被观察的全部细胞的百分数达到1
‑
2%以上时，就可以判定此时的芹菜愈伤组织细胞达到完全胚性化。另外，为了使得鉴别结果的可靠性，在计算细胞的分裂频度的同时，再引入一个参数
‑
核占比作为判定依据，具体计算方法是统计100
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200个细胞，用测微尺分别测量被观测细胞核与细胞的直径，计算它们的比值。当这一比值达到40
‑
60%时，就可以基本判断这些细胞处于完全胚性化状态。将上述两个指标相结合，二者同时达到相应的标准时，就可以判定芹菜愈伤组织已经达到了完全胚性化。
[0008]（5）验证判断芹菜愈伤组织完全胚性化标准可靠性的方法：将判定为完全胚性化的芹菜愈伤组织转接到无激素的培养基上进行培养，培养温度为25
‑
28℃，1000 Lx连续光照，经过50
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60 d后就可以看到通过胚性化再生出的完整植株，而且每块愈伤组织上都能看到数量不等的再生苗长出。再经过移栽培养获得生长正常的芹菜植株，此时就可以判断此鉴别标准是可靠的。
[0009]本专利技术进一步公开了鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法在有效提高芹菜愈伤组织胚性再生效率的应用。试验结果显示通过此方法获取的芹菜体细胞胚和再生植株显著增多。
[0010]本专利技术加详细的描述如下：（1）芹菜外植体的制备：选取饱满的芹菜种子，先用70%无水酒精浸泡30s,放入无菌水1min,接下来用次氯酸钠溶液（不同芹菜品种的浓度不同）进行表面消毒，再用无菌水冲洗3次，最后放到带滤纸的培养皿将表面的水吸干，将其播种到1/2MS培养基上，在培养室中进行培养。经过10
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20 d时间，带种子子叶完全展开后，取下胚轴为外植体，进行愈伤组织的诱导。培养条件为：24 h连续光照，光照强度为1000 Lx，培养温度为25℃。
[0011]（2）芹菜愈伤组织的快速培养：芹菜愈伤组织用解剖刀从外植体上切下，并切成直径3 mm大小的小块，将其接种到提前配制好的培养基上。培养基的配置过程与前一步骤相同，采用MS+0.5
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2 mg/LKT+0
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0.2 mg/L NAA+1
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2 mg/L2,4
‑
D+30g/L蔗糖的培养基。培养条件与前面一致。
[0012]（3）芹菜松散型愈伤组织的诱导：将诱导出的芹菜愈伤组织转接到MS+0.5
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1 mg/LKT+0
‑
0.2 mg/L NAA+0.5
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1 mg/L2,4
‑
D+30g/L蔗糖的培养基上。愈伤组织培养条件调整为2000 Lx光照，24 h光周期，培养温度在23℃。每次继代时间为15 d，继代培养要选择结构松散，质地较硬，颜色为黄绿色的愈伤组织。经过3
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5次继代培养获得芹菜松散型愈伤组织。
[0013]（4）芹菜松散型胚性愈伤组织的诱导：将诱导出的芹菜松散型愈伤组织转接到MS+0.1
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0.5 mg/LKT+0.5
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1 mg/L2,4
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D+30g/L蔗糖的培养基上。培养条件与前面一致。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）芹菜愈伤组织的准备：将诱导出的芹菜愈伤组织从培养中的器皿中取出，挑取1
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2mm的小块放到载玻片上，滴2
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3滴卡诺氏固定液进行固定，固定时间5
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10分钟；（2）芹菜愈伤组织的染色：用滤纸将放在载玻片上的愈伤组织周围的固定液吸干，滴1滴事先配制好的卡宝品红或醋酸洋红染色液进行染色，染色时间为10
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15分钟，染色温度为25
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28℃；（3）染色后的愈伤组织在载玻片上直接盖上盖玻片，用压片机进行压片，使得愈伤组织细胞均匀分散开；将制作好的压片放到显微镜下进行观察，根据镜检结果判断芹菜愈伤组织胚性化程度；（4）鉴别芹菜愈伤组织完全胚性化的标准：在显微观察的视野下，以能够看清细胞的细胞核和细胞基本轮廓为前提，在放大200
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400倍的条件下进行观察计数；判断愈伤组织细胞完全胚性化的依据是分别选取不同视野下统计细胞的总数量在500
‑
1000个，当被统计的...

【专利技术属性】
技术研发人员：董洪雨，刘艳军，许丁帆，黄俊轩，李建科，武春霞，梁兴，
申请(专利权)人：天津农学院，
类型：发明
国别省市：