【技术实现步骤摘要】
一种体外肺纤维化类器官模型的构建方法
[0001]本专利技术涉及一种体外肺纤维化类器官模型的构建方法。
技术介绍
[0002]特发性肺纤维化(IPF)是一种病因不明的慢性进行性间质性肺疾病,病程多呈慢性、进行性,病变多发生于胸膜下和基底部,HRCT可见网格状阴影、蜂窝状改变伴或不伴牵拉支气管扩张,好发于中年男性。据统计,IPF的发病率为2~29/10万人,且每年以11%的比例在增长,患者的平均生存期只有3~5年,5年生存期仅有30%。目前,该疾病的治疗尚不能有效逆转或阻止肺纤维化的发展,《特发性肺纤维化临床治疗推荐指南》中推荐的两大治疗药物:尼达尼布和吡非尼酮也仅能有限地延缓轻中度IPF患者的疾病进展,且这两种药物还存在一定的不良反应。
[0003]深入对肺纤维化疾病机理和治疗相关的研究以推动IPF新药研发的进展是目前该疾病治疗领域的重中之重。体外疾病模型的构建对于上述研究而言起着举足轻重的作用。传统的新药研发过程往往长达10~20年,其成功率、时间周期和资金成本都严格受到模型的限制,而传统的肺纤维化模型多为不同化合物处理的动物模型(如博来霉素处理的小鼠模型),该模型的局限性在于造模时间长、差异大、成本高和明显的种属差异;2D培养的细胞系模型虽然成本低,大大简化了操作难度,但由于只有单一组分的细胞且难以还原体内细胞真实的病理状态,因而其应用也具有极大的局限性。
[0004]3D培养的类器官(Organoids)可以兼具动物和细胞模型的优点,不仅丰富了模型中的细胞组成,重建了组织的部分结构和功能,而且可 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种体外肺纤维化类器官模型的构建方法,其特征在于按以下步骤进行:(1)肺类器官的悬浮培养:
①
利用胶滴包埋方式培养肺类器官,培养至肺类器官生长至可传代时,吸走培养皿中的培养基,加入TrypLE Express消化液;将胶滴吹散后,进行消化;
②
待肺类器官消化至小细胞团块,往小细胞团块中加入DMEM/F12培养基以终止消化,获得消化后细胞;
③
收集消化后细胞进行离心操作,然后弃去培养基上清,进行细胞计数,获得离心后细胞;
④
按每毫升10~30万细胞密度,将离心后细胞用肺类器官培养基重悬后转移至低吸附6孔板中,进行悬浮培养;
⑤
培养3~5天后,将肺类器官培养基更换为含TGF
‑
β1或含博来霉素的肺类器官培养基,继续培养2~3天,获得用于后续共培养的悬浮培养肺类器官;(2)成纤维细胞与肺类器官共培养:
①
培养至细胞贴壁生长覆盖面积为培养皿面积80~90%的成纤维细胞,将培养基吸走后,用PBS洗涤成纤维细胞,加入TrypLE Express消化液进行消化;
②
拍打培养皿使消化完成的细胞脱离板底,往培养皿中加入体积为消化液体积3~5倍的成纤维细胞培养基终止消化;收集细胞离心然后弃去培养基上清,进行细胞计数,获得消化好的成纤维细胞;
③
收集悬浮培养肺类器官,离心然后弃去培养基上清,加入TrypLE Express消化液将悬浮培养肺类器官重悬,然后加入DMEM/F12培养基以终止消化,获得二次消化的肺类器官;
④
收集二次消化的肺类器官进行离心操作,然后弃去培养基上清,进行细胞计数,获得消化好的肺类器官;
⑤
将消化好的成纤维细胞与消化好的肺类器官进行共培养:用肺类器官培养基分别重悬成纤维细胞和肺类器官;依次将重悬后的成纤维细胞和重悬后的肺类器官转移至同一个低吸附培养皿中,补充肺类器官培养基,并在肺类器官培养基中Matrigel胶,将细胞板继续进行共培养3~5天,并观察细胞共培养状态,获得共培养细胞;(3)肺纤维化模型构建和抗肺纤维化药物的药效检测;
①
配制肺纤维化诱导培养基:在肺类器官培养基中加入TGF
‑
β1;
②
配制抗肺纤维化药物
‑
肺纤维化诱导培养基1:在肺类器官培养基中加入TGF
‑
β1和尼达尼布;
③
配制抗肺纤维化药物
‑
肺纤维化诱导培养基2:在肺类器官培养基中加入TGF
‑
β1和吡非尼酮;
④
配制抗肺纤维化药物
‑
肺纤维化诱导培养基3:在肺类器官培养基中加入TGF
‑
β1,尼达尼布和吡非尼酮;
⑤
利用上述构建的成纤维细胞
‑
肺类器官共培养体系,设置1个空白对照组和4个实验组:空白对照组中的培养基更换为新鲜的肺类器官培养基;实验组1中的培养基更换为肺纤维化诱导培养基;实验组2中的培养基更换为抗肺纤维化药物
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【专利技术属性】
技术研发人员:邹欢,朱宇,陈泽新,黄敏,
申请(专利权)人:创芯国际生物科技广州有限公司,
类型:发明
国别省市:
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