一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法技术

本发明专利技术涉及细胞培养技术领域，具体涉及一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法，包括以下依次进行的步骤：将含血清甲基纤维素清液与胶原蛋白液混合获得细胞成球培养基；所述胶原蛋白液的原料包括PBS、I型鼠尾胶原、NaOH溶液和水；将血管内皮细胞、基础培养基和甲基纤维素清液混合，获得接种液；将接种液接种于位于培养皿中的细胞成球培养基中，形成若干小液滴；将培养皿倒置培养，并在培养皿上放置重物，经培养获得内皮细胞球。本技术方案可以解决现有技术的血管内皮细胞成球诱导培养的成球率不理想的技术问题，细胞球出芽后的芽体在显微镜下清晰，且降低了实验成本，为进行关于基因和药物对血管生成影响的研究创造了更优的条件。件。件。

【技术实现步骤摘要】
一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法。

技术介绍

[0002]血管生成(Angiogenesis)是从已有的血管上通过出芽(Sprouting)的方式形成完整的血管网络的过程。基于球体的出芽试验是研究基因和药物对血管内皮细胞毛细血管样管形成影响的一种成熟可靠的方法。该方法的一个主要优点是可以在3D环境中研究血管生成。将血管内皮细胞以悬滴法培养形成球状体，并将这些球状体嵌入胶原中，24小时后分析管的形成，通过分析出芽数和出芽长度，可以研究基因或药物对血管生成的影响。但现有技术中，血管内皮细胞成球的方式并不稳定，且试验成本较高，出芽后的芽体在显微镜下不清晰，不容易观察到，给后续研究过程造成了阻碍。中国专利CN112961821A公开了一种高效三维培养血管内皮细胞的方法，包括以下步骤：a,配制甲基纤维素培养基；b,接种内皮细胞到低粘附平面形成悬滴；c,18
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24小时后收集内皮细胞微组织球体；d，内皮细胞微组织球体进行出芽实验检测其血管新生能力。但是采用现有技术的操作方法，仍然存在内皮细胞成球率较低的问题。亟需对诱导血管内皮细胞成球以及出芽的方法进行改进，以提升细胞成球率和简化操作过程。

技术实现思路

[0003]本专利技术意在提供一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法，以解决现有技术的血管内皮细胞成球诱导培养的技术方案成球率不理想的技术问题。
[0004]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0005]一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法，包括以下依次进行的步骤：
[0006]S1配制细胞成球培养基：将含血清甲基纤维素清液与胶原蛋白液混合获得细胞成球培养基；所述胶原蛋白液的原料包括PBS、I型鼠尾胶原、NaOH溶液和水；
[0007]S2细胞成球培养：将血管内皮细胞、基础培养基和甲基纤维素清液混合，获得接种液；将接种液接种于位于培养皿中的细胞成球培养基中，形成若干小液滴；将培养皿倒置培养，并在培养皿上放置重物，经培养获得内皮细胞球。
[0008]本方案的原理及优点是：
[0009]在本技术方案中，将含有血管内皮细胞的液滴加入特别配制的细胞成球培养基中，再通过倒置培养皿使细胞悬液形成悬滴，进而培养促进细胞成球，获得细胞球。专利技术人在前期的实验中，并未采用在倒置的培养皿顶部压重物的技术方案，细胞成球率一直不理想。专利技术人最初认为是培养基配方原因导致的成球率不佳，但是在多次对配方进行改良处理后，成球率低的问题仍然没有得到有效解决。在一次偶然的机会下，在倒置培养皿的顶部附加了重物，意外发现内皮细胞的成球率得到了非常显著的提升。专利技术人分析原因可能在于由于重物的重力作用，使得培养皿和培养皿盖之间盖合得更紧，增加了密闭性，而更高的
密闭性有利于细胞成球的过程。
[0010]本技术方案有效地提升了内皮细胞成球率，并且无需使用专用10cm方形皿和试剂储液槽，节省了试验成本，具有广阔的应用前景。经过培养获得的成球的内皮细胞可以作为筛选药物的体外模型，也可以作为研究基因功能和生物信号通路的体外模型，应用于科研以及药物筛选的实践操作中。
[0011]进一步，在S2中，将培养皿倒置培养的方法为：接种后，盖上培养皿盖，将培养皿倒置，培养皿盖中盛放有PBS；将多个倒置的培养皿叠放，并在最顶层的培养皿上放置重物。
[0012]进一步，在S2中，培养皿的规格为10cm；培养皿盖中盛放的PBS的体积为2mL；所述重物为盛放有10ml PBS的培养皿。
[0013]在倒置的皿盖上加入PBS，使培养皿内的环境保持湿润，能够有效提高细胞的成球率。
[0014]进一步，在S2中，血管内皮细胞为人微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和小鼠脑微血管内皮细胞中的一种；在接种液中，血管内皮细胞和基础培养基的总和与甲基纤维素清液的体积比为4:1，每5mL接种液中含有1
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106‑2×
106个血管内皮细胞；一个小液滴含有25μl接种液。
[0015]采用本技术方案可以对包括人微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和小鼠脑微血管内皮细胞等在内的内皮细胞进行培养，并成功获得用于后续出芽实验的细胞球。
[0016]进一步，在S2中，培养获得内皮细胞球的条件为37℃、24h。
[0017]进一步，在S1中，含血清甲基纤维素清液由如下方法配制而成：在甲基纤维素清液中加入体积百分数为20％的胎牛血清；所述甲基纤维素清液由如下方法配制：将灭菌后的甲基纤维素溶胀于加热后的基础培养基，然后再加入常温的基础培养基，待甲基纤维素完全溶解后离心取上清液，获得甲基纤维素清液。
[0018]甲基纤维素粉末在预热后的基础培养基溶液中迅速分散、溶胀，再加入常温基础培养基，使瓶内温度降低，从而使降温后的甲基纤维素迅速溶解。
[0019]进一步，在S1中，所述胶原蛋白液的配制方法为：首先将PBS和NaOH溶液混合，再加入预冷后的水混合，最后加入I型鼠尾胶原混合；胶原蛋白液中胶原蛋白的终浓度为2mg/ml；PBS的用量为胶原蛋白液体积的十分之一。
[0020]进一步，在S1中，含血清甲基纤维素清液与胶原蛋白液的体积比为1:1。
[0021]通过上述方法可以保证胶原蛋白在溶液中的充分分散，保证获得的细胞成球培养基质地更为均匀，保证了成球效果。
[0022]进一步，还包括S3细胞球包被：取含有内皮细胞球的液滴，经离心取内皮细胞球后，依次加入含血清甲基纤维素清液和胶原蛋白液，获得细胞球混合液；将细胞球混合液加入培养板后，经培养后再加入完全培养基，再经培养后获得出芽的内皮细胞球。
[0023]进一步，在S3中，血清甲基纤维素清液和胶原蛋白液的体积比为1:1；将细胞球混合液加入培养板后，经37℃条件下30分钟的培养，再加入完全培养基，再经37℃条件下24h的培养后获得出芽的内皮细胞球；所述完全培养基为含有10％血清和1％双抗的基础培养基。
[0024]通过细胞球包被以及出芽诱导，可以用于检测细胞球血管生成潜力。本方案的内皮细胞球可以作为筛选药物的体外模型，也可以作为研究基因功能和生物信号通路的体外
模型，应用于科研以及药物筛选的实践操作中。
[0025]综上所述，本申请方案通过将细胞悬液在培养皿中形成分开的液滴，盖上皿盖后，倒置形成细胞液悬滴，再用PBS封闭皿盖，使培养皿整体环境湿润且密封，能够有效提高内皮细胞成球的稳定性，内皮细胞成球的成功率高达95％以上，方法简单有效。本技术方案无需使用专用10cm方形皿和试剂储液槽，节省了试验成本；再通过本申请方案给出的三种血管内皮细胞以及其适合成球的细胞数目，拓宽了血管内皮细胞的适用情况，且细胞球在显微镜放大40倍时，就能更好得观察到细胞球被包埋在胶内的三维结构，且能够更加容易清晰地观察到细胞出芽。
附图说明
[0026]图1为本专利技术实施例1的人微血管内皮细胞成球的显微镜图。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法，其特征在于：包括以下依次进行的步骤：S1配制细胞成球培养基：将含血清甲基纤维素清液与胶原蛋白液混合获得细胞成球培养基；所述胶原蛋白液的原料包括PBS、I型鼠尾胶原、NaOH溶液和水；S2细胞成球培养：将血管内皮细胞、基础培养基和甲基纤维素清液混合，获得接种液；将接种液接种于位于培养皿中的细胞成球培养基中，形成若干小液滴；将培养皿倒置培养，并在培养皿上放置重物，经培养获得内皮细胞球。2.根据权利要求1所述的一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法，其特征在于：在S2中，将培养皿倒置培养的方法为：接种后，盖上培养皿盖，将培养皿倒置，培养皿盖中盛放有PBS；将多个倒置的培养皿叠放，并在最顶层的培养皿上放置重物。3.根据权利要求1所述的一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法，其特征在于：在S2中，培养皿的规格为10cm；培养皿盖中盛放的PBS的体积为2mL；所述重物为盛放有10ml PBS的培养皿。4.根据权利要求3所述的一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法，其特征在于：在S2中，血管内皮细胞为人微血管内皮细胞、人脐静脉内皮细胞和小鼠脑微血管内皮细胞中的一种；在接种液中，血管内皮细胞和基础培养基的总和与甲基纤维素清液的体积比为4:1，每5mL接种液中含有1
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106个血管内皮细胞；一个小液滴含有25μl接种液。5.根据权利要求4所述的一种诱导血管内皮细胞成球和出芽的方法，其特征在于：在S2中，培养获得内皮细胞球的条件为37℃、24h。6.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨德琴，许媛，吴娜，
申请(专利权)人：重庆医科大学附属口腔医院，
类型：发明
国别省市：