鼻黏膜的体外培养方法和培养液技术

本发明专利技术提供了一种鼻黏膜的体外培养方法和培养液，所述培养液的成分包括Wnt/β

【技术实现步骤摘要】
鼻黏膜的体外培养方法和培养液


[0001]本专利技术涉及生物医药
，具体涉及一种鼻黏膜的体外培养方法和培养液。

技术介绍

[0002]鼻腔作为吸入空气的主要通道，它不仅充当前线呼吸防御机制，还是呼吸道病原体感染与复制的主要场所。从解剖学上讲，人类的鼻腔里有一层一种假复层纤毛上皮，散布有微管蛋白+分泌粘液的杯状细胞，由基底细胞分化而来来自p63+上皮的干细胞层。人鼻粘膜上皮是多种上呼吸道病毒易感组织。
[0003]现有技术中，鼻腔的病毒感染研究通常是用动物模型完成，通过小鼠、兔等动物感染病毒后，处死后观察鼻腔的病理改变。但是，由于有的病毒呈现种属特性，如新冠病毒，易感染人类。如果用动物实验，难以复制人鼻黏膜的病毒感染情况。如果用人体进行实验，则违反伦理。如果采用鼻黏膜进行实验，往往离体后短时间就出现组织细胞死亡，根本无法完成感染的实验过程。
[0004]因此，亟需一种鼻黏膜离体存活系统，能够顺利进行鼻黏膜病毒感染，完成实验过程。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种鼻黏膜的体外培养方法，以及用于体外培养的培养液，本专利技术提供的培养液和培养方法可将鼻黏膜进行体外培养，可以保持至少2周的活性，并拥有完整的上皮屏障与免疫系统，能够复制人体内的病毒感染过程，从而可以实现离体鼻黏膜病毒感染实验。
[0006]本专利技术采用的技术方案是提供一种鼻黏膜的体外培养液，所述培养液的成分包括：
[0007][0008]优选所述培养液的成分由以下组分组成：
[0009][0010][0011]优选地，所述DMEM/F12培养基中含有L
‑
谷氨酰胺和15mM Hepes缓冲剂。
[0012]优选地，所述Wnt/β
‑
catenin信号通路激活剂为R
‑
spondin1蛋白、Wnt
‑
3a蛋白、FH535中的一种或多种，Wnt/β
‑
catenin信号通路激活剂是促分化、诱导更新的生长因子。优选为R
‑
spondin1蛋白。
[0013]优选地，所述成纤维细胞生长因子为FGF7、FGF10、FGF
‑
4中的一种或两种，成纤维细胞生长因子可以促进上皮细胞生长。
[0014]优选地，所述TGF
‑
β抑制剂为Noggin、A83
‑
01、Compound C dihydrochloride中的
一种或两种，其中，优选noggin是骨形态发生蛋白的内源性抑制剂，A83
‑
01是TGF
‑
βⅠ型受体抑制剂，调节细胞分化、增殖和凋亡。
[0015]优选地，所述ROCK抑制剂包括Y27632、S1049Y
‑
27632 2HCl、ZINC00881524、GSK269962A、M20594、Y
‑
33075中的一种或多种，优选Y27632。ROCK抑制剂可防止细胞凋亡。
[0016]优选地，所述P38 MAPK抑制剂包括SB202190、SB431542、BIRB796中的一种或多种，优选SB202190。P38 MAPK抑制剂诱导细胞分化。
[0017]优选地，所述无血清添加剂为B27，可抗氧化。
[0018]N
‑
乙酰半胱氨酸可以抗氧化损伤，抗坏死。
[0019]烟酰胺/维生素B3是辅酶前体，可调节蛋白、糖代谢。
[0020]GlutaMax添加剂为二肽营养素，为细胞生长提供营养。
[0021]抗生素青霉素、链霉素、Primocin可杀灭细菌和真菌。
[0022]进一步地，优选所述鼻黏膜的体外培养液的成分包括：
[0023]更优选地，所述鼻黏膜的体外培养液的成分包括：
[0024][0025][0026]本专利技术还提供了一种利用所述体外培养液体外培养鼻黏膜的方法，所述方法包括以下步骤：
[0027]步骤(1)：组织收集；
[0028]将鼻黏膜离体后，浸泡在生理盐水中保存；
[0029]步骤(2)：清洗；
[0030]用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗离体的鼻粘膜，除去血块、粘液和骨片；
[0031]步骤(3)：培养液中培养；
[0032]将清洗后的鼻黏膜置入体外培养液中，在细胞培养箱中培养。体外培养的鼻黏膜组织可进行后续实验。
[0033]优选地，所述步骤(1)中，鼻黏膜浸泡在生理盐水中保存的时间小于6小时
[0034]优选地，所述步骤(3)中，鼻黏膜离体后12小时内尽快置入体外培养液中培养。
[0035]优选地，所述步骤(3)中，细胞培养箱中的培养环境为37℃、5％CO2。
[0036]优选地，所述步骤(2)中，以鼻黏膜的完整性作为活性标准，在显微镜下观察到纤毛摆动，视为上皮细胞仍有活性。在本专利技术的培养液中，鼻黏膜可体外培养2周，仍然完整有活性。
[0037]优选地，本专利技术提供的体外培养的鼻黏膜，可用于体外病毒感染实验。
[0038]本专利技术还提供了一种利用体外培养的鼻黏膜进行体外病毒感染实验的方法，所述体外培养的鼻黏膜利用上述的鼻黏膜的体外培养液进行体外培养。
[0039]本专利技术提供了一种体外培养液，可将鼻黏膜进行体外培养，可以保持至少2周的活性，并拥有完整的上皮屏障与免疫系统，能够复制人体内的病毒感染过程，我们的研究表明，病毒能够成功感染培养的鼻黏膜，并通过切片观察到病毒蛋白的表达，从而可以实现离体鼻黏膜病毒感染实验。
附图说明
[0040]图1为鼻粘膜组织培养和新型冠状病毒(SARS
‑
CoV
‑
2)感染流程示意图。
[0041]图2为鼻粘膜组织培养的第1、4和7天的显微镜明场下观察的照片。
[0042]图3为鼻粘膜组织培养第7天DAPI和HE染色图，其中C图是DAPI染色图，D图是HE染色图。
[0043]图4为鼻粘膜组织未感染和感染病毒后72小时的显微镜照片。
[0044]图5为鼻粘膜组织未感染和感染病毒后72小时DAPI和HE染色图。
[0045]图6为鼻粘膜组织未感染和感染病毒24小时，新型冠状病毒核衣壳蛋白(SARS
‑
CoV
‑
2N蛋白)和病毒受体血管紧张素转换酶2(ACE2)的免疫荧光染色图。
[0046]图7为鼻粘膜组织未感染和感染病毒48小时的HE染色图和病毒感染48小时后SARS
‑
CoV
‑
2N蛋白和病毒受体ACE2的免疫荧光染色图。
[0047]图8为SARS
‑
CoV
‑
2N蛋白和纤毛细胞特异性标志物微管蛋白的免疫荧光染色图。
具体实施方式
[0048]下面通过具体实施例对本专利技术的技术方案进行详细说明，但本专利技术的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鼻黏膜的体外培养液，其特征在于，所述体外培养液的成分包括：2.如权利要求1所述的鼻黏膜的体外培养液，其特征在于，所述Wnt/β
‑
catenin信号通路激活剂为R
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spondin1蛋白、Wnt
‑
3a蛋白、FH535中的一种或多种；所述成纤维细胞生长因子为FGF7、FGF10、FGF
‑
4中的一种或两种；所述TGF
‑
β抑制剂为Noggin、A83
‑
01、Compound C dihydrochloride中的一种或两种；所述ROCK抑制剂包括Y27632、S1049Y
‑
27632 2HCl、ZINC00881524、GSK269962A、M20594、Y
‑
33075中的一种或多种；所述P38 MAPK抑制剂包括SB202190、SB431542、BIRB796中的一种或多种。3.如权利要求2所述的鼻黏膜的体外培养液，其特征在于，所述体外培养液的成分包括：
4.如权...

【专利技术属性】
技术研发人员：余少卿，赖菊，
申请(专利权)人：上海市同济医院，
类型：发明
国别省市：