骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用技术

本发明专利技术涉及骨髓涂片染色技术领域，具体涉及骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用。本发明专利技术提供的骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒包括一抗试剂、二抗试剂和染色剂，一抗试剂中包括CD41单克隆抗体、CD42b单克隆抗体或CD61单克隆抗体中至少一种，二抗试剂包括碱性磷酸酶标记的二抗聚合物，染色剂包括快红染色试剂和苏木素复染试剂。采用该试剂盒对骨髓细胞进行染色，染色结果表明，本发明专利技术提供的试剂盒染色特异性强，信号表达准确且清晰，无背景非特异染色问题，染色方法方便快捷。染色方法方便快捷。

【技术实现步骤摘要】
骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用


[0001]本专利技术涉及骨髓涂片染色
，具体涉及骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒、染色方法及应用。

技术介绍

[0002]骨髓增生异常综合征(MDS)是一组起源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，其特点是髓系细胞发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，高风险向急性髓系白血病(AML)转化。MDS主要表现为粒、红和巨核三系病态造血，而巨核系病态主要表现为明显增多的微小巨核细胞，尤其是淋巴样小巨核细胞。
[0003]微小巨核细胞是一类形态异常的小型巨核细胞，见于多种血液病，是骨髓病态造血的特征之一。目前病态小巨核细胞已被列为MDS的诊断指标之一。由于其体积较小，形态多样，临床上靠形态学常规瑞氏
‑
姬姆萨染色，常常难以识别和认定这种小巨核细胞，易与淋巴细胞、幼稚红细胞等相混淆，漏检率高。因此用特殊的染色方法或巨核细胞免疫组化的染色方法，将小型巨核细胞着色，小核型巨核细胞阳性，对骨髓增生异常综合征的诊断、分型有重要意义。
[0004]骨髓增生异常综合征中国诊断与治疗指南(2019年版)中明确提到：怀疑为MDS的患者应行Gomori银染色和原位免疫组化(immunohistochemistry，IHC)，常用的检测标志包括CD34、MPO、GPA、CD61、CD42、CD68、CD20和CD3。细胞形态学检查结果提示巨核细胞病态造血，免疫细胞化学染色检测发现一定比例的小、微巨核细胞。2010年国际MDS血液病理学工作会议建议，骨髓石蜡切片选择1～2个巨核细胞标志物，包括CD42b、CD61、CD31及CD41。
[0005]目前，市面上采用的骨髓涂片染色方法包括SP法、SAP染色法、APAAP染色法、亲和素
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生物素
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过氧化物酶技术等，这些方法均存在一定缺陷，如步骤繁琐、需要多步抗体孵育、操作时间长、与内源性生物素结合的问题、增强阳性信号的同时也增加了非特异性背景染色等。
[0006]CN104865377A提供了一种用CD41和CD61抗体联合标记的骨髓涂片微小巨核细胞染色试剂盒。该方法存在以下缺陷：
①
CD41、CD61两种抗体鸡尾酒方式联合标记进行免疫组化染色，步骤繁琐，灵敏度和特异性难以兼得；
②
制备好的骨髓血涂片样本没有经过固定，细胞固有形态及结构难以更好的维持，且抗原有可能弥散或失活；
③
采用抗原修复液对骨髓血涂片样本进行抗原热修复，一方面本来就没有经过固定的骨髓血涂片样本，高温热修复极易破坏细胞形态，且导致细胞脱片，另一方面，加热及降温时间长且需要加热设备，过程繁琐；
④
采用辣根过氧化物酶标记的DAB显色系统，3％过氧化氢封闭处理不能完全消除内源性过氧化物酶，导致最终染色结果出现中性粒细胞非特异性染色，影响结果的准确判读。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种骨髓涂片小巨核细胞染色试剂
盒、染色方法及应用，本专利技术提供了检测灵敏度高，特异性好，操作简单同时避免了背景非特异性染色问题的染色试剂盒及染色方法。
[0008]本专利技术提供了骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒，包括：一抗试剂、二抗试剂和染色剂；
[0009]所述一抗试剂包括抗体和抗体稀释剂，所述抗体选自CD41单克隆抗体、CD42b单克隆抗体或CD61单克隆抗体中至少一种；
[0010]所述二抗试剂包括碱性磷酸酶标记的二抗聚合物；
[0011]所述染色剂包括快红显色剂和苏木素复染试剂。
[0012]CD41单克隆抗体、CD42b单克隆抗体或CD61单克隆抗体有助于巨核细胞的识别，配合碱性磷酸酶(AP)标记的二抗试剂、快红染色试剂和苏木素复染试剂，可以明显提高微小巨核细胞的检出率，对于MDS的早期诊断及鉴别诊断具有重要的临床价值。
[0013]本专利技术实施例中，所述试剂盒中试剂组成如下表：
[0014][0015]本专利技术中，所述抗体稀释剂包含水、Tris
‑
HCl、牛血清白蛋白、氯化钠、非离子表面活性剂、果绿色素和抑菌剂。相比其他抗体稀释剂，本专利技术提供的所述抗体稀释剂为所述抗体提供了更加稳定的工作环境，可以更长时间的保证抗体的稳定性及抗体特异性，从而获得更准确的技术效果。
[0016]在一些具体实施例中，所述非离子表面活性剂为Tween
‑
20，所述抑菌剂为ProClin 950。相比较其他试剂，Tween
‑
20和ProClin 950分别作为表面活性剂与抑菌剂应用于抗体稀释剂中，与抗体的兼容性好，能够更有效的配合抗体和其他试剂完成检测，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
[0017]进一步优选的，所述抗体稀释剂由水和6g/L Tris
‑
HCl、15g/L牛血清白蛋白、8.5g/L氯化钠、0.1vol％的Tween
‑
20、0.01wt％的果绿色素和0.15wt％的ProClin 950组成，所述抗体稀释剂的pH为7.60
±
0.05。实验表明，在此浓度及pH下，所述抗体稀释剂与抗体的兼容性最高。
[0018]本专利技术中，所述二抗试剂包含水、碱性磷酸酶标记的二抗聚合物、Tris、蛋白保护剂、氯化钠、Tween
‑
20、抑菌剂、酶保护剂和稳定剂Ⅳ。相比其他试剂，本专利技术所述的二抗试剂能够更特异、稳定的与所述一抗试剂及其他试剂配合使用，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
[0019]在一些具体实施例中，所述蛋白保护剂为牛血清白蛋白，所述酶保护剂为金属离子，所述酶保护剂包括锌离子、镁离子、钙离子中的一种或多种混合物，所述稳定剂Ⅳ为甘油，所述抑菌剂为ProClin 950。相比较其他试剂，牛血清白蛋白、甘油和ProClin 950分别作为蛋白保护剂、稳定剂与抑菌剂应用于所述二抗试剂中，与抗体的兼容性好，能够更有效的配合抗体和其他试剂完成检测，从而获得更准确、更灵敏的技术效果。
[0020]进一步优选的，所述二抗试剂由水和8～12μg/mL碱性磷酸酶标记的抗兔聚合物、6g/L Tris、10g/L牛血清白蛋白、8.5g/L氯化钠、3g/L Tween
‑
20、0.1wt％的ProClin 950、0.1～1mM酶保护剂和40vol％的甘油，所述酶保护剂为金属离子，所述酶保护剂包括锌离子、镁离子、钙离子中的一种或多种混合物，所述二抗试剂的pH为7.20
±
0.05。实验表明，在此浓度及pH下，所述二抗试剂与所述一抗试剂的特异性结合效果最佳。
[0021]更进一步的优选的，所述锌离子来自氯化锌，所述镁离子来自氯化镁。
[0022]本专利技术中，所述快红染色试剂包括：快红显色剂、快红活化剂和快红缓冲液；
[0023]所述快红显色剂包括芳伯胺类化合物和无机强酸，所述芳伯胺类化合物为碱本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.骨髓涂片小巨核细胞染色试剂盒，其特征在于，包括：一抗试剂、二抗试剂和染色剂；所述一抗试剂包括抗体和抗体稀释剂，所述抗体选自CD41单克隆抗体、CD42b单克隆抗体或CD61单克隆抗体中至少一种；所述二抗试剂包括碱性磷酸酶标记的二抗聚合物；所述染色剂包括快红染色试剂和苏木素复染试剂。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释剂包含水、Tris
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HCl、牛血清白蛋白、氯化钠、Tween
‑
20、果绿色素和ProClin 950。3.如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述抗体稀释剂由水和6g/L Tris
‑
HCl、15g/L牛血清白蛋白、8.5g/L氯化钠、0.1vol％的Tween
‑
20、0.01wt％的果绿色素和0.15wt％ProClin 950组成，所述抗体稀释剂的pH为7.60
±
0.05。4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述二抗试剂包含水、碱性磷酸酶标记的二抗聚合物、Tris、牛血清白蛋白、氯化钠、Tween
‑
20、ProClin 950、酶保护剂和甘油，所述酶保护剂为金属离子，所述酶保护剂包括锌离子、镁离子、钙离子中的一种或多种混合物。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述二抗试剂由水和8～12μg/mL碱性磷酸酶标记的抗兔聚合物、6g/L Tris、10g/L牛血清白蛋白、8.5g/L氯化钠、3g/L Tween
‑
20、0.1wt％的ProClin 950、0.1～1mM酶保护剂和40vol％的甘油，所述酶保护剂为金属离子，所述酶保护剂包括锌离子、镁离子、钙离子中的一种或多种混合物，所述二抗试剂的pH为7.20
±
0.05。6.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述快红染色试剂包括：快红显色剂、快红活化剂和快红缓冲液；所述快红显色剂包括芳伯胺类化合物和无机强酸，所述芳伯胺类化合物为碱性品红、新品红、3
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氨基
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甲氧基苯甲酰胺中的任意一种，所述无机强...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢雅南，李三华，米贯勋，张林姿，牛银银，齐华，
申请(专利权)人：河南赛诺特生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：