一种适用于猕猴桃根组织单细胞测序的植物细胞核制备以及悬液优化方法技术

本发明专利技术公开了一种适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，通过独创的裂解液配方和细胞核悬液优化方法制备得到细胞核质量很高。与现有技术中6～7种组分的裂解液配方相比，本发明专利技术裂解液配方显著减少；实验流程在30分钟内即可完成细胞核的制备。本发明专利技术所述方法避免蔗糖沉积等步骤，节约试剂、耗材，降低成本，同时大大缩短时间，提高效率，便于大量样本实验的开展。本发明专利技术还公开了一种KR裂解液，试剂/试剂盒及其在制备适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的方法中的应用。猴桃根组织细胞核的方法中的应用。

【技术实现步骤摘要】
一种适用于猕猴桃根组织单细胞测序的植物细胞核制备以及悬液优化方法


[0001]本专利技术属于生物
，涉及植物细胞核的制备方法，具体涉及一种猕猴桃根组织的细胞核制备方法及其在植物单细胞测序中的应用和使用方法。

技术介绍

[0002]单细胞测序技术通过测定单个细胞的转录组，以“单细胞分辨力”来解析生命现象背后的分子机制，是生命科学研究的尖端技术手段，得到了广泛应用。然而，由于细胞壁的存在，植物组织进行单细胞测序“困难重重”，必须先将植物细胞解离为原生质体才能进行单细胞测序。细胞壁的主要成分是纤维素等多糖类物质，这些大分子结构多变，化学性质稳定，是最难于降解的物质之一。因此，目前多数植物组织很难制备到满足单细胞测序要求的原生质体，极大的限制了植物单细胞测序研究。另外，制备原生质体对植物细胞造成非常大的改变，会诱发转录变化，导致测序结果可靠性严重降低，数据无法反映真实的生物学变化。
[0003]为了规避组织分离细胞困难以及解离过程造成的数据失真等问题，动物组织会采用单细胞核测序来开展实验，收到了非常好的效果。因此，借鉴动物组织中的方式，通过制备植物细胞核来开展植物单细胞测序是突破当前技术难题的有效手段。但当前植物组织制备细胞核的方法，都是应用于拟南芥的相关研究，不适用于猕猴桃根组织研究，猕猴桃根组织制备细胞核后，细胞核数量、细胞碎片比例等指标无法满足单细胞测序的要求，亟需开发一种新的适用于猕猴桃根组织植物单细胞测序研究的细胞核制备方法。

技术实现思路

[0004]拟南芥虽然有成熟的细胞核制备技术方案，如《Identification of Open Chromatin Regions in Plant Genomes Using ATAC
‑
Seq》与《Isolation of Plant Root Nuclei for Single Cell RNA Sequencing》中所述实验步骤，前者主要应用于拟南芥的基因组测序研究，后者主要应用于转录组测序研究，两种方法可以分别制备拟南芥叶和根组织的细胞核悬液。猕猴桃为大型落叶藤本，与拟南芥的组织相似性极低，细胞壁组成成分差异较大，且由于生长环境不同，组织和细胞的组成也有较大差异。使用拟南芥制备细胞核的方法无法制备满足单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核悬液。
[0005]针对现有技术的空白和存在的不足，本专利技术在大量的深入研究和实验的基础上，提供了一种适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，及相应的裂解液配方和细胞核悬液优化方法(其中，本专利技术所述细胞核悬液优化方法，主要优化的内容为，去除猕猴桃根组织/细胞中沉积的草酸钙晶体、去除提取猕猴桃根组织过程中释放到悬液中的mRNA、去除细胞核悬液中的组织碎片)。
[0006]本专利技术提供的适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，包括如下具体步骤：
[0007]1)配置KR裂解液：首先配置KR裂解液，并将配置好的溶液预冷。
[0008]2)破碎样本：将新鲜取材或者冻存的猕猴桃根组织样本转入离心管，加入所预冷的KR裂解液及钢珠，依照仪器操作说明置于破碎仪上对组织进行破碎。
[0009]3)裂解细胞：破碎后将离心管置于冰上孵育裂解。
[0010]4)筛网过滤：将步骤3)裂解后的组织裂解液转入离心管中，加入预冷的PBS。冰上静置1分钟。吸出组织裂解液，加入滤网中进行过滤。
[0011]5)筛网过滤：使用滤网对步骤4)中的过滤液再进行一次过滤。
[0012]6)离心收集沉淀：将步骤5)中的过滤液进行离心。丢弃上清，沉淀使用PBS进行重悬。
[0013]7)过滤：将步骤6)中的沉淀重悬液全部加入分选柱中进行过滤。
[0014]8)离心收集沉淀：将步骤7)中的过滤液进行离心，丢弃上清，沉淀使用100μLPBS进行重悬。
[0015]步骤(1)中，所述KR裂解液包含以下成份(终浓度)：
[0016]2％～3％(v/v)L
‑
酒石酸(Nanjing Reagent,C0681014023)、15～25mM柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素(Nanjing Reagent,8047
‑
15
‑
2)、0.2～0.4U/mL RNase inhibitor(重组型RNase抑制剂(鼠源)，ACCURATE BIOLOGY,AG11613)；优选地，为3％(v/v)L
‑
酒石酸(Nanjing Reagent,C0681014023)、25mM柠檬酸钠、0.4％(m/v)皂素(Nanjing Reagent,8047
‑
15
‑
2)、0.4U/mL RNase inhibitor(重组型RNase抑制剂(鼠源)，ACCURATE BIOLOGY,AG11613)。
[0017]步骤(1)中，L
‑
酒石酸常用作饮料和其他食品的酸味剂，在本专利技术中作用为中和组织和细胞破碎后释放的细胞内容物，稳定裂解液PH，保持细胞核完整；同时L
‑
酒石酸作为裂解液中的还原剂，发挥保持RNase inhibitor(RNA酶抑制剂)的活性的作用。
[0018]步骤(1)中，皂素主要作用是医药原料，同时也被用于防腐材料、乳化剂成分，在本专利技术中，皂素作为裂解液的成分发挥裂解细胞膜，释放细胞核的作用。
[0019]步骤(1)中，配置KR裂解液时需要先加入2％～3％(v/v)L
‑
酒石酸(Nanjing Reagent,C0681014023)，将溶液充分混匀并置于冰上预冷后再加入0.2～0.4U/mL RNase inhibitor。其目的是2％～3％(v/v)L
‑
酒石酸(Nanjing Reagent,C0681014023)可以保持0.2～0.4U/mL RNase inhibitor的活性。
[0020]步骤(1)中，所述预冷温度为0～5℃；优选地，为放置于4℃冰箱预冷。
[0021]步骤(2)中，所述离心管为 2.0mL MaxyClear Snaplock Microcentrifuge Tube，RNase
‑
/DNase
‑
free and nonpyrogenic(Axygen,MCT
‑
200
‑
C)(爱思进2.0ml无核酸酶透明离心管)。
[0022]步骤(2)中，破碎仪常用于核酸抽提工作，在本专利技术中的作用是通过钢珠充分破坏植物组织，辅助KR裂解液完成粗细胞核悬液的制备。
[0023]步骤(2)中，所述钢珠的直径为5mm。
[0024]步骤(2)中，所述破碎仪为万柏生物高通量组织破碎仪(onebio
‑
48p)。
[0025]步骤(2)中，所述破碎的条件为1200～1300rpm，170～180s；优选地，为1200本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种适用于单细胞测序的猕猴桃根组织细胞核的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：1)配置KR裂解液：首先配置KR裂解液，并将配置好的溶液预冷；2)破碎样本：将新鲜取材或者冻存的猕猴桃根组织样本转入离心管，加入预冷的所述KR裂解液及钢珠，依照仪器操作说明置于破碎仪上对组织进行破碎；3)裂解细胞：破碎后将离心管置于冰上孵育裂解；4)筛网过滤：将裂解后的组织裂解液转入离心管中，加入预冷的PBS，冰上静置1分钟，吸出组织裂解液，加入滤网中进行过滤得到过滤液；5)筛网过滤：使用滤网对步骤4)中的过滤液再进行一次过滤；6)离心收集沉淀：将步骤5)中的过滤液进行离心，丢弃上清，沉淀使用PBS进行重悬；7)过滤：将步骤6)中的沉淀重悬液全部加入分选柱中进行过滤；8)离心收集沉淀：将步骤7)中的过滤液进行离心，丢弃上清，沉淀使用PBS进行重悬。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述KR裂解液包含以下成份(终浓度)：2％～3％(v/v)L
‑
酒石酸、15～25mM柠檬酸钠、0.2～0.4％(m/v)皂素、0.2～0.4U/mL重组型RNase抑制剂。3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述破碎仪为万柏生物高通量组织破碎仪；所述破碎的条件为1200～1300rpm，170～180s；所述1ml的KR裂解液中添加50～100mg猕猴桃根组织。4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述孵...

【专利技术属性】
技术研发人员：范黎明，朱燕敏，佟思雨，王佳琦，殷昊，肖云平，
申请(专利权)人：上海欧易生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：