环状DNA的扩增方法技术

本发明专利技术提供可在无细胞系统中简便并且指数扩增环状DNA、特别是长链环状DNA的方法。具体而言，提供环状DNA的扩增方法，其包括使有复制起始序列(origin of chromosome(oriC))的环状DNA与含以下的酶组反应：(1)催化环状DNA的复制的第一酶组；(2)催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶组；及(3)催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组，以及缓冲液、NTP、dNTP、镁离子源、及碱金属离子源的反应液混合而生成的反应混合物。金属离子源的反应液混合而生成的反应混合物。金属离子源的反应液混合而生成的反应混合物。

【技术实现步骤摘要】
环状DNA的扩增方法
[0001]本申请是2017年5月17日提交的同名专利技术专利申请201780034209.1的分案申请。


[0002]本专利技术涉及环状DNA的扩增方法。更具体而言，涉及可在无细胞系统中指数扩增环状DNA的方法。

技术介绍

[0003]成为生物技术发展的基础的DNA克隆技术是使由DNA片段的切割粘贴调制的环状DNA在大肠杆菌等的细胞内作为质粒扩增的方法。在利用使用细胞的DNA克隆技术而扩增环状DNA时，细胞培养及扩增产物的提取－纯化等的烦琐的顺序变得必要。另外，由于有为了进行使用细胞的DNA克隆而制出基因重组生物的必要，可实验的环境上有限制。
[0004]作为在试管内扩增DNA的方法，一般使用聚合酶链式反应(PCR)。但是，由利用PCR的试管内DNA扩增法无法直接扩增环状DNA。作为环状DNA的试管内扩增法，有滚环扩增法(RCA)等(非专利文献1、专利文献1、专利文献2、专利文献3)。但是，为了用滚环扩增法扩增环状DNA，有每次设计对目标DNA具有特异性的引物的必要。另外，由滚环扩增法的直接的扩增本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.环状DNA的扩增方法，其包括以下的工序：(1)形成成为模板的环状DNA和含以下物质的反应液的反应混合物的工序：催化环状DNA的复制的第一酶组；催化冈崎片段连接反应而合成形成环连体的2个姊妹环状DNA的第二酶组；催化2个姊妹环状DNA的分离反应的第三酶组；缓冲液；ATP；GTP、CTP及UTP；dNTP；镁离子源；及碱金属离子源；其中所述环状DNA含能与有DnaA活性的酶结合的复制起始序列(origin of chromosome(oriC))；及(2)将在工序(1)中形成的反应混合物在等温条件下保温的工序。2.权利要求1所述的方法，其中反应液还含直链状DNA特异性外切核酸酶及/或RecG型解螺旋酶。3.权利要求1所述的方法，其中反应液还含蛋白质的非特异吸附抑制剂、及/或核酸的非特异吸附抑制剂、铵盐、RecG型解螺旋酶及/或单链DNA特异性外切核酸酶、直链状DNA特异性外切核酸酶及/或单链DNA特异性外切核酸酶、或DNA的稳定化因子。4.权利要求1所述的方法，其中第一酶组含具有DnaA活性的酶、1种以上的核样体蛋白质、有DNA促旋酶活性的酶或酶组、单链DNA结合蛋白质(single
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strand binding protein(SSB))、有DnaB型解螺旋酶活性的酶、有DNA解螺旋酶装载体活性的酶、有DNA引发酶活性的酶、有DNA夹活性的酶、及有DNA聚合酶III*活性的酶或酶组的组合，第二酶组含具有DNA聚合酶I活性的酶及有DNA连接酶活性的酶的组合，第三酶组含具有拓扑异构酶III活性的酶及/或有拓扑异构酶IV活性的酶，且任选地第二酶组还含具有RNA酶H活性的酶，第三酶组还含具有RecQ型解螺旋酶活性的酶，或在第一酶组中，1种以上的核样体蛋白质是IHF或HU，有DNA促旋酶活性的酶或酶组是由GyrA及GyrB构成的复合物，有DnaB型解螺旋酶活性的酶是DnaB解螺旋酶，有DNA解螺旋酶装载体活性的酶是DnaC解螺旋酶装载体，有DNA引发酶活性的酶是DnaG引发酶，有DNA夹活性的酶是DnaN夹，
有DNA聚合酶III*活性的酶或酶组是含DnaX、HolA、HolB、HolC、HolD、DnaE、DnaQ、及HolE之任一者的酶或酶组。5.权利要求1所述的方法，其中在工...

【专利技术属性】
技术研发人员：末次正幸，辻本宽子，篠原赳，
申请(专利权)人：奥利希罗基因组学有限公司，
类型：发明
国别省市：