用于脱除内毒素的偶联多粘菌素B的冷冻凝胶、制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及一种冷冻凝胶层析柱，特别涉及一种用于脱除内毒素的偶联多粘菌素B的冷冻凝胶、制备方法及其应用，属于生物医学材料领域。该方法包括如下步骤：S1、丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶的合成，S2、冷冻凝胶的环氧活化，S3、多粘菌素B的偶联。本发明专利技术首先将丙烯酰胺体系引入甲基丙烯酸羟乙酯，在引发剂的作用下进行冷冻交联，得到丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶；然后，将该丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶用环氧氯丙烷进行环氧活化，使其具有更多的环氧基，用于后续的偶联反应；最后，将环氧活化后的冷冻凝胶偶联多粘菌素B，并验证了其在样品中的应用效果。验证了其在样品中的应用效果。

【技术实现步骤摘要】
用于脱除内毒素的偶联多粘菌素B的冷冻凝胶、制备方法及其应用


[0001]本专利技术涉及一种冷冻凝胶层析柱，特别涉及一种用于脱除内毒素的偶联多粘菌素B的冷冻凝胶、制备方法及其应用，属于生物医学材料领域。

技术介绍

[0002]内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁的特有结构，是由脂质A、蛋白质和多糖组成的脂多糖，在细菌死亡或分解后被释放出来。内毒素是脓毒症发病的主要致病因子，在极微量的情况下便可使机体产生不良反应。内毒素可以导致发热、低血压、弥漫性血管内凝血、代谢紊乱以及器官衰竭等症状，甚至造成死亡。内毒素的结构非常稳定，在160℃的温度下加热2至4个小时，或用强碱、强酸或强氧化剂加温煮沸30分钟以上才能破坏它的生物活性。
[0003]目前，许多生物制品为了提高其产品安全性，都需要对其存在的内毒素含量进行控制。革兰氏阴性菌也被广泛地应用于重组产品如多肽、核酸和蛋白的生产，疫苗的研发中也需要对内毒素进行必要的脱除处理，提高其在应用时的安全性。医疗注射制剂中内毒素的检测和控制尤为重要，过量的内毒素不仅不会发挥应有的医疗效果，还会对目标机体产生损伤。通过裂解宿主菌、增殖培养的方式制备的噬菌体裂解液中存在的高浓度内毒素是制约噬菌体产品安全性的主要因素。
[0004]目前内毒素去除方法包括(1)超滤法：使用膜分离技术，基于分子量大小去除内毒素的超滤法，适合用于小分子溶液中内毒素的去除，但在拥有蛋白质等大分子物质的溶液中，超滤法会导致大量目标大分子流失。(2)吸附法：吸附法包括亲和吸附法和活性炭吸附法。在内毒素去除中最常用的为亲和吸附法，多以琼脂糖为基质，通过与内毒素有特异性吸附作用的配基进行偶联，配基往往带有正电荷，会与内毒素的理算基团产生离子作用，使配基对内毒素有较高的选择特异性；活性炭吸附法则是发挥活性炭表面积大、吸附能力强和价格便宜的优点，活性炭吸附法在酸性条件下去除效果较好，但对内毒素的特异性较差。(3)离子交换层析法：离子交换层析法是根据样品和内毒素等电点的不同，选用不同的阴离子和阳离子交换介质，使内毒素分离以达到目标物纯化的目的。
[0005]现有的内毒素脱除方法有明显的局限性，而进口商品化内毒素吸附柱也存在成本高和效率低的问题，吸附效果也往往达不到标明的效果，蛋白回收率往往不到60％且不适于反复多次使用。反复使用导致柱压过高，给需要控制内毒素要求的生物产品规模化制备和生产带来极大的困难。
[0006]综上，建立一种针对液体样品内毒素的快速脱除柱是非常有必要的。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于用于脱除内毒素的偶联多粘菌素B的冷冻凝胶层析柱，用于样品中内毒素的脱除，以改善上述技术问题。
[0008]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0009]一种偶联多粘菌素B的冷冻凝胶的制备方法，该方法包括如下步骤：
[0010]S1、丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶的合成
[0011]原料组成：由丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯组成的聚合单体，亚甲基双丙烯酰胺，烯丙基缩水甘油醚，以及适量的活化剂四甲基乙二胺、引发剂过硫酸铵和水；
[0012]在冰浴下，将聚合单体、亚甲基双丙烯酰胺与水混合至充分溶解，再加入烯丙基缩水甘油醚，随后加入活化剂四甲基乙二胺，排气，然后下体系中加入过硫酸铵混合充分，排气后将混合液转入封口的注射器中，
‑
12℃至
‑
15℃条件下聚合反应过夜，得到冷冻凝胶；
[0013]S2、冷冻凝胶的环氧活化
[0014]得到的冷冻凝胶水洗至无反应残留液体流出，用1
‑
5mol/L的NaOH溶液使凝胶充分置换为碱性环境，
[0015]将冷冻凝胶浸没在碱性的含有环氧氯丙烷的溶液体系中，震荡下在该溶液体系中滴加二甲基亚砜至完全混溶，进行环氧活化；
[0016]反应结束后，用甘氨酸封闭羟基，再用丙酮反复清洗，得到活化后的丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶；
[0017]S3、多粘菌素B的偶联
[0018]将活化好的丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶与充分溶解的2
‑
6mg/mL多粘菌素B溶液在180
±
50r/min的37
±
2℃摇床进行偶联，充分偶联后的凝胶浸没于1
‑
3mol/LNaOH溶液中，加入硼氢化钠溶液进行封端反应，水洗，得到的偶联多粘菌素B的冷冻凝胶置于20％乙醇，4℃保存。
[0019]本专利技术中，亚甲基双丙烯酰胺作为制备聚丙烯酰胺凝胶的交联剂，烯丙基缩水甘油醚分子内既含有碳碳双键又有环氧键，是重要的聚合单体和有机合成中间体。
[0020]S1中，
‑
12℃至
‑
15℃的反应温度需要严格控制，温度过高，则还未反应就会形成凝胶，导致其孔隙小、很硬、质地较差，温度太低则导致快速结冰，分子间无法流动，反应缓慢甚至停止。
[0021]本专利技术首先将丙烯酰胺体系引入甲基丙烯酸羟乙酯，在引发剂的作用下进行冷冻交联，得到丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶；然后，将该丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶用环氧氯丙烷进行环氧活化，使其具有更多的环氧基，用于后续的偶联反应；最后，将环氧活化后的冷冻凝胶偶联多粘菌素B，并验证了其在样品中的应用效果。
[0022]本专利技术所采用的冷冻凝胶与传统填充柱有所不同，冷冻凝胶是指在溶剂凝固点以下制备的3D大孔聚合物凝胶。其中，冰晶在形成凝胶的过程中发挥致孔的作用，解冻后形成凝胶产生相互连接、贯通的三维大孔结构。冷冻凝胶整体材料可以改善溶质的扩散，增加溶质分子同聚合物内部基团互相作用的机会。冷冻凝胶内的传递随流动发生，流动相和固定相之间可以快速传递。液体流动期间，冷冻凝胶的大孔径和平滑的流动通道也可以保证柱压处于较低状态，有效避免柱堵塞现象。由单体聚合而成的冷冻凝胶整体材料一般本身不具有吸附目标物质的能力，因此，需要在冷冻凝胶整体材料结构上接枝具有对目标特异性吸附能力的功能基团。通常将含有功能基团的单体加到共聚体系中，再通过配体与功能基团的化学反应对冷冻凝胶进行偶联改性。
[0023]多粘菌素B(PolymixinB，PMB)是一种环状的碱性亲脂性多肽类抗生素，对沙门氏菌等多种革兰氏阴性菌有抑制作用。多粘菌素B可以对内毒素有吸附作用，主要是由于其二
氨基丁酸阴离子残基能够与脂质A的一磷酸、二磷酸基团等产生静电结合作用改变脂质A的立体构象，同时末端疏水性脂肪链可与脂质A的疏水端结合，破坏格兰仕阴性菌膜的通透性并达到吸附内毒素的效果。
[0024]作为优选，聚合单体中，丙烯酰胺与甲基丙烯酸羟乙酯的体积质量比为1：1
‑
1.5，最佳质量比为9:11，聚合单体总量占原料总重量的5
‑
8％，最佳值为6％。本专利技术中，原料甲基丙烯酸羟乙酯的用量极为重要，聚合单体中丙烯酰胺(AM)和甲基丙烯酸羟乙酯(HE)的质量比为9:11时，凝胶层析柱溶胀度高，活化后的环氧基密度也处于本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种偶联多粘菌素B的冷冻凝胶的制备方法，其特征在于该方法包括如下步骤：S1、丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶的合成原料组成：由丙烯酰胺和甲基丙烯酸羟乙酯组成的聚合单体，亚甲基双丙烯酰胺，烯丙基缩水甘油醚，以及适量的活化剂四甲基乙二胺、引发剂过硫酸铵和水；在冰浴下，将聚合单体、亚甲基双丙烯酰胺与水混合至充分溶解，再加入烯丙基缩水甘油醚，随后加入活化剂四甲基乙二胺，排气，然后下体系中加入过硫酸铵混合充分，排气后将混合液转入封口的注射器中，
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12℃至
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15℃条件下聚合反应过夜，得到冷冻凝胶；S2、冷冻凝胶的环氧活化得到的冷冻凝胶水洗至无反应残留液体流出，用1
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5mol/L的NaOH溶液使凝胶充分置换为碱性环境，将冷冻凝胶浸没在碱性的含有环氧氯丙烷的溶液体系中，震荡下在该溶液体系中滴加二甲基亚砜至完全混溶，进行环氧活化；反应结束后，用甘氨酸封闭羟基，再用丙酮反复清洗，得到活化后的丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶；S3、多粘菌素B的偶联将活化好的丙烯酰胺/甲基丙烯酸羟乙酯冷冻凝胶与充分溶解的2
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6mg/mL多粘菌素B溶液在180
±
50r/min的37
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2℃摇床进行偶联，充分偶联后的凝胶浸没于1
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3mol/L NaOH溶液中，加入硼氢化钠溶液进行封端反应，水洗，得到的偶联多粘菌素B的冷冻凝胶置于20％乙醇，4℃保存。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：聚合单体中，丙烯酰胺与甲基丙烯酸羟乙酯的体积质量比为1：1
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1.5，聚合单体总量占原料总重量的5
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8％。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：原料组成是：甲基丙烯酸羟乙酯2.15
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2.3mL，丙烯酰胺2.6
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2.75g...

【专利技术属性】
技术研发人员：王静雪，林洪，刘培基，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：