一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖及其提取方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖及其提取方法和应用，涉及青霉菌领域，针对现有的无法分离出产黄青霉菌灭活菌丝体多糖中具体的活性成分，使得产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的应用受到制约的问题。本发明专利技术确切公布了产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的结构和制备方法，包括乙醇沉淀、酶解除蛋白、凝胶色谱柱分离纯化，红外光谱、高效液相色谱、核磁共振分析结构，制备的产黄青霉菌灭活菌丝体多糖对烟草花叶病毒的防治具有较好的效果，制备的产黄青霉菌灭活菌丝体多糖使得产黄青霉菌灭活菌丝体有效成分更为明确，制备方法简单，药理更为清楚，为开发天然抗病毒制剂提供了依据和方法，在天然产物抗植物病害领域具有广泛的适用性。在天然产物抗植物病害领域具有广泛的适用性。

【技术实现步骤摘要】
一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖及其提取方法和应用


[0001]本专利技术涉及青霉菌领域，尤其涉及一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖及其提取方法和应用。

技术介绍

[0002]多糖具有免疫调节、抗肿瘤、抗感染、降血脂、降血糖、抗衰老及抗病毒等多种活性，真菌多糖的抗病毒活性近年被越来愈多的研究者关注，真菌多糖通过诱发植物抗性、激发植物免疫力、抑制病毒侵染复制、预防和体外钝化病毒病的作用达到防治植物病毒病的目的，例如平菇多糖、金针菇多糖、香菇多糖等能防治植物病毒。
[0003]产黄青霉菌灭活菌丝体多糖是青霉菌发酵生产青霉素的剩余副产品，含有 90％的有机物质、7％N、1％P和2％K，产黄青霉菌灭活菌丝体多糖可诱导植物表达病程相关蛋白，对甜瓜黄萎病、西瓜枯萎病、棉花枯萎病、烟草黑胫病、烟草赤星病和烟草花叶病具有一定防治效果，研究人员利用分子筛层析和离子交换层析对产黄青霉菌灭活菌丝体多糖进行了有效成分的分离纯化，但没有得到较好的分离结果，仅通过酶解试验推测产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的有效成分可能是蛋白或者多肽，但也有研究发现用产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的水提物进行灌根，对棉花枯萎病的防效可达51
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77％，对棉花黄萎病也有显著的防治效果，进一步用产黄青霉菌灭活菌丝体多糖水提取液中分子量大于2KD的部分施用于葡萄、苹果、马铃薯、洋葱和番茄等作物上，能够提高这些作物对多种真菌病害的抗病性，尽管产黄青霉菌灭活菌丝体多糖对多种作物的多种病害都具有很好的防治作用，但是都没能分离出具体的活性成分，没能明确具体的活性成分的结构，使得产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的应用受到制约。
[0004]烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus，TMV)被成为烟草的癌症，已经威胁到烟叶生产的可持续发展，目前TMV的防治主要采取培育抗病品种、施用化学农药和综合防治管理等措施，但在实际生产中，抗病品种培育周期长、种植适应性不理想，化学防治导致环境污染，而农业措施不能从根本上达到有效控制TMV 的目的，20世纪60年代随着人们发现病原生物、植物提取物和非生物化学试剂等能诱导植物获得抗病性后，诱导植物获得系统抗性来抵御病害的生化制剂备受关注，蛋白、多肽、植保素和多糖等在生产上得到开发和应用。
[0005]青霉菌属于真菌，其菌丝体中富含大量的多糖，目前还没有产黄青霉菌灭活菌丝体多糖多糖提取的文献报道和专利，因此亟需要一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖多糖及其制备方法，来解决上述问题。

技术实现思路

[0006](一)专利技术目的
[0007]有鉴于此，本专利技术的目的在于提出一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖及其提取方法和应用，以实现对产黄青霉菌灭活菌丝体多糖中具体的活性成分的分析、提取与应用。
[0008](二)技术方案
[0009]为达到上述技术目的，本专利技术提供了一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖：
[0010]其包括如下原料：所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖由甘露糖、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖组成，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖分子连接方式为A片段
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B片段
ꢀ‑
C片段，所述片段A片段、B片段和C片段分子结构如下：
[0011][0012][0013]优选的，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的总糖含量为100％。
[0014]优选的，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖为中性糖。
[0015]优选的，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖分子量为19.5KDa。
[0016]本专利技术还提供了一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的提取方法，包括如下步骤：
[0017]步骤一：取高温烘干的青霉菌菌丝体，按照每100g青霉菌菌丝体加入1.6L 蒸馏水的比例浸泡过夜，次日100℃煮提2
‑
4h，纱布过滤保留上清，向残渣中加入与浸泡时相同体
积的蒸馏水，继续煮提2
‑
4h，纱布过滤保留上清，合并两次提取液，浓缩体积至原体积的1/20，4000rpm离心15min，弃沉淀，向浓缩液中加入95％乙醇，至乙醇终浓度为80％，静置过夜，第二天用4000rpm离心15min，收集沉淀，冷冻干燥；
[0018]步骤二：将步骤一得到的沉淀物质称重，按照每100g加入400mL蒸馏水的比例溶解粗沉淀物质，待沉淀物质充分溶解后，加入95％乙醇，至乙醇终浓度为 60％，4℃醇沉1.5
‑
3h，4000rpm离心15min，收集沉淀，用95％乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤一次，冷冻干燥沉淀；
[0019]步骤三：将步骤二得到的沉淀物质称重，加入适量蒸馏水溶解直至底物浓度为10mg/mL，按照酶底质量比为4％的比例加入胰蛋白酶进行酶解，30
‑
40℃反应1h，100℃煮沸10min使酶失活，4000rpm离心15min，取上清，冷冻干燥过夜；
[0020]步骤四:将步骤三冷冻干燥得到的沉淀用10倍质量的蒸馏水溶解，室温下充分搅拌至其完全溶解，将样品溶液装入截留量为3.5KDa的透析袋中，在蒸馏水中进行透析，透析4
‑
6次，每次3h，收集透析袋内溶液，冷冻干燥；
[0021]步骤五：将步骤四冷冻干燥得到的沉淀用0.5倍质量的蒸馏水溶解，室温下充分搅拌至其完全溶解，上样至已装填平衡完全的凝胶色谱柱，用0.15M的NaCl 洗脱液洗脱，流速0.4mL/min，15min/管，溶液将按分子量从大到小的顺序依次被洗脱下来，使用苯酚
‑
硫酸法测定各试管中样品糖含量，收集至无糖检出，获得两级份DPS和DPS
‑
1溶液；
[0022]步骤六：将DPS溶液装入截留量为3.5KDa的透析袋中，在蒸馏水中进行透析，透析2
‑
4次，每次3h，收集透析袋内溶液，冷冻干燥，即得到产黄青霉菌灭活菌丝体多糖活性多糖，置于干燥器中保存，备用。
[0023]优选的，所述步骤一中两次煮提时间最佳皆为3h；所述步骤二醇沉时间最佳为2h；所述步骤三中反应温度最佳是37℃；步骤四中透析次数最佳为5次；所述步骤六中透析次数最佳为3次。
[0024]本专利技术还提供了一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的应用，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖在防治烟草花叶病毒中的应用。
[0025]优选的，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖预防心叶烟感染烟草花叶病毒的浓度为100μg/mL。
[0026]优选的，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖抑制栽培K326中烟草花叶病毒扩散的浓度为100μg/mL。
[0027]从以上技术方案可以看出，本申请具有以下有益效果：
[0028]1：本专利技术提供的一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖及其提取的方法和应用，使得产黄青霉菌灭活菌丝体有效成分更为明确，药理更为清楚。
[0029]2：本专利技术使得产黄青霉菌灭活菌丝体多糖在防治植物病害领域方法更为准确，药效更易控制，为烟草病害的防治提供了具有开发前景的活性成分。
具体实施方式
[0030]下本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖，其特征在于，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖由甘露糖、半乳糖、葡萄糖和鼠李糖组成，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖分子连接方式为A片段
‑
B片段
‑
C片段，所述A片段、B片段和C片段分子结构如下：AAC2.根据权利要求1所述的一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖，其特征在于，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的总糖含量为100％。3.根据权利要求1所述的一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖，其特征在于，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖为中性糖。4.根据权利要求1所述的一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖，其特征在于，所述产黄青霉菌灭活菌丝体多糖分子量为19.5KDa。5.一种产黄青霉菌灭活菌丝体多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：取高温烘干的青霉菌菌丝体，按照每100g青霉菌菌丝体加入1.6L蒸馏水的比例浸泡过夜，次日100℃煮提2
‑
4h，纱布过滤保留上清，向残渣中加入与浸泡时相同体积的蒸馏水，继续煮提2
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4h，纱布过滤保留上清，合并两次提取液，浓缩体积至原体积的1/20，4000rpm离心15min，弃沉淀，向浓缩液中加入95％乙醇，至乙醇终浓度为80％，静置过夜，第二天用4000rpm离心15min，收集沉淀，冷冻干燥；步骤二：将步骤一得到的沉淀物质称重，按照每100g加入400mL蒸馏水的比例溶解粗沉淀物质，待沉淀物质充分溶解后，加入95％乙醇，至乙醇终浓度为60％，4℃醇沉1.5
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3h，4000rpm离心15min，收集沉淀，用95％乙醇洗涤两次，无水乙醇洗涤一次，冷冻干燥沉淀；步骤三：将步骤二得到的沉淀物质称重，加入适量蒸馏水溶解直至底物浓度为10mg/mL，按照酶底质量比为4％的比例加入胰蛋白酶进行酶解，30
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【专利技术属性】
技术研发人员：王建光，付坚，陈穗云，代瑾然，李妤，廖菊够，焦梦婷，马丹，唐菊，
申请(专利权)人：云南大学，
类型：发明
国别省市：