一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合制造技术

本发明专利技术提供一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合，涉及生物技术领域。该一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合，包括34条序列EGFR、KRAS、BRAF突变基因的引物和探针。通过使用Taqman探针与数字PCR方法检测测肺癌EGFR、KRAS、BRAF基因突变，标准PCR反应体系经过微滴发生后，分配到约30000个微滴中，每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数，数字PCR平台相对于常规QPCR平台灵敏度高，可通过血液样本进行检测，可以节省组织样本。可以节省组织样本。

【技术实现步骤摘要】
一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合


[0001]本专利技术涉及生物
，具体为一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合。

技术介绍

[0002]肺癌是世界范围内常见的癌症，发病率和死亡率居各癌症之首。2002年全世界肺癌的新发病率为138万，近一半(49.9％)发生在发展中国家。据2008年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万。肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤，肺癌的死亡例数远大于乳腺癌、结肠癌和前列腺癌死亡例数的总和(Orras JM，Fernandez E，Gonzalez JR，et.，al.Lung cancer mortality in European regions(1955
‑
1997).Ann Oncol，2003，14(1)：159
‑
161；中华人民共和国卫生部，《2008年中国卫生统计》年鉴)。
[0003]肺癌从组织病理学上可以分为两大类：小细胞癌(SCLC)和非小细胞癌(NSCLC)，其中非小细胞癌约占所有肺癌病例数85％，包括鳞癌、腺癌和大细胞癌。发达国家的肺癌患者的5年生存率为15
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20％，而我国肺癌患者5年生存率仅为10％。其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相匹配的科学的治疗方案，从而失去了治疗的最佳时机。因此，肺癌的基因突变检测和诊断技术，对于制定与之相匹配的科学有效的化疗方案，提高肺癌患者的生存率，延长生存期有着重大的现实意义。
[0004]目前，约有70％的肺癌患者仍接受化疗，为了使肺癌患者能接受到最好的治疗，提高生存率，延长患者生存期。实施以驱动性基因突变分型治疗是肿瘤化疗必然趋势。对肺癌患者肿瘤药物靶点及相关的驱动性基因突变的了解是实施肺癌突变特异性治疗(Mutation Specific Therapy)和制定正确化疗方案的前提和基础。2011年《美国国立癌症综合网络(NCCN)临床实践指南》已经明确把EGFR，KRAS，BRAF等驱动性突变的检测应该在实施化疗前成为常规化。因此，在实施化疗之前对于肺癌主要的突变基因的检测，对于提高了肺癌患者的生存率，延长患者生存期，避免过度治疗有着主要的现实意义。
[0005]驱动性突变基因属体细胞稀有突变，具有稀少性、异质性、不稳定性等特点。因而，驱动性突变基因分子检测必须具备较高的灵敏度。研究发现，驱动性突变的量往往都低于直接测序等技术所能达到的检测限，所以直接测序等技术无法满足驱动性突变基因检测的实际需求。因此，迫切需要开发一种检测肺癌多重突变基因的引物探针组合，以实现采用快速、高灵敏度检测方法搭配PCR检测技术对肺癌患者进行多重“基因突变”的检测，从而为制定肺癌患者的个体化用药方案和耐药处理方案提供科学参考依据。

技术实现思路

[0006]针对现有技术的不足，本专利技术提供了一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合，解决了可通过血液样本进行检测，节省组织样本的问题。
[0007]为实现以上目的，本专利技术通过以下技术方案予以实现：一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合，包括34条序列EGFR、KRAS、BRAF突变基因的引物和探针，如下表所示：
[0008][0009][0010][0011]优选的，本专利技术还提供了上述引物和探针的反应体系，包括：PCR反应体系：2
×
PCR反应液10μL、各对引物200～900nmol、各对探针200～900nmol，总体积为20μL；反应体系中包含相应的EGFR、KARS、BRAF基因突变检测和内控检测试剂，突变VIC信号指示，内控FAN信号指示；
[0012]突变类型如下表：
[0013]试剂管FAM通道VIC通道
1内控19
‑
del2内控L858R3内控T790M4内控G719A5内控G719S6内控G719C7内控S768I8内控L861Q9内控G12C10内控V600E。
[0014]优选的，本专利技术还提供了一种试剂盒，该试剂盒包括SEQ ID NO：1～34序列。
[0015]优选的，本专利技术还提供了一种使用上述试剂盒进行数字PCR检测的方法，包括以下步骤：
[0016]S1、配制PCR体系：
[0017][0018][0019][0020][0021][0022][0023][0024][0025][0026][0027][0028][0029]；
[0030]S2、加入模板后，将20uL反应体系加入到DG8cartridge中间一排的8个孔内；在DG8cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油，并盖上胶垫；将以上holder平稳
放置于微滴生成仪中，开始生成微滴，微滴生成于cartridge最上面一排孔内；使用排枪枪头缓慢进行吸取，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内；转移油滴进入96孔板内完成后，将膜有红线标记的一面朝上置于96孔板上并固定好，用预热好的热封仪对其进行封膜；确认各样品孔是否密封好；
[0031]S3、设置PCR反应程序
[0032]；
[0033][0034]S4、读取结果
[0035]将之前完成PCR的96孔板放入plate holder中组装好，组装好之后放入微滴读取仪中，打开QuantaSoft软件对96孔板中样品信息进行Setup，完成后即可进行Run，结束后结果会被自动Analyze；
[0036]S5、结果判读
[0037]总微滴数>10000，并检测到内控阳性时，结果才有效；靶标检测到阳性微滴即为阳性。
[0038]优选的，该实验使用各突变位点的质粒模板，结果如下：
[0039]突变位点检测结果19
‑
del阳性L858R阳性T790M阳性G719A阳性G719S阳性G719C阳性S768I阳性L861Q阳性G12C阳性V600E阳性。
[0040]优选的，不足8个样品时用稀释一倍的20ul 1
×
buffer control补足。
[0041]本专利技术提供了一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合。具备以下有益效
果：
[0042]本专利技术通过使用Taqman探针与数字PCR方法检测测肺癌EGFR、KRAS、BRAF基因突变，标准PCR反应体系经过微滴发生后，分配到约30000个微滴中，每个微滴包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，实现“单分子模板PCR扩增”，扩增结束后含有核酸分子模板的微滴会给出荧光信号，最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，分析软件可计算给出目的分子的浓度或拷贝数，数字PCR平台相对于常规QPCR平台灵敏度高，可通过血液样本进行检测，可以节省组织样本；数字PCR平台的绝对定量优势，可进行动态检测。
具体实施方式
[0043]下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合，其特征在于：包括34条序列EGFR、KRAS、BRAF突变基因的引物和探针，如下表所示：
2.根据权利要求1所述的一次性检测肺癌多重基因突变的引物探针组合，其特征在于：所述引物和探针的反应体系，包括：PCR反应体系：2
×
PCR反应液10μL、各对引物200～900nmol、各对探针200～900nmol，总体积为20μL。3.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的引物探针组合物。4.根据权利要求3所述的一种试剂盒进行数字PCR的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：S1、配制PCR体系：S1、配制PCR体系：
S2、加入模板后，将20uL反应体系加入到DG8 cartridge中间一排的8个孔内；在DG8 cartridge最底下一排8个孔中各加入70ul微滴生成油，并盖上胶垫；将以上holder平稳放

【专利技术属性】
技术研发人员：彭德镇，李泽卿，薛俊杰，
申请(专利权)人：南昌新纪元医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：