一种PCR检测试剂用表面活性剂及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种PCR检测试剂用表面活性剂及其制备方法和应用，这种全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂上下两侧均对称分布有两个羟基，可在PCR检测，特别是微滴式数字PCR法中作为表面活性剂制备油相使用，形成油包水微液滴，实现其在PCR扩增的微流控液滴处理过程中的应用。相邻全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂分子间通过相互平行的两个分子间氢键相互连接，进而在靠近液滴的表层形成一层稳定的“层状膜”，在PCR扩增循环实验中，这层膜能够有效增强微液滴稳定性，并抑制微液滴间发生小分子转移，通过改变油水界面表面张力的大小稳定PCR扩增的微液滴，避免微液滴融合破碎，提高PCR检测结果准确性。准确性。准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种PCR检测试剂用表面活性剂及其制备方法和应用


[0001]本专利技术涉及PCR检测
，具体涉及一种PCR检测试剂用表面活性剂及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]数字PCR技术（Digital PCR，dPCR）是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸分子绝对定量技术，相较于荧光定量PCR技术即qPCR技术，数字PCR技术通过直接计数的方法能够直接实现起始DNA模板的绝对定量，通常采用微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微液滴或微反应腔内，即将整体的反应体系分隔成众多微小独立反应体系，核酸模板在分隔过程中被充分稀释，每个反应体系中的核酸模板数少于或者等于1个，经过PCR循环之后，所有液滴的荧光将逐个被识别并进行计数，不需要构建标准曲线，就可以得到DNA模板的绝对定量结果，有一个核酸分子模板的反应体系就会给出荧光信号，没有模板的反应体系就没有荧光信号，根据相对比例和反应体系的体积，可以推算出原始溶液的核酸浓度。但是由于液滴表面张力较大，液滴容易聚集趋于融合，会影响检测结果，因此，提高微液滴的稳定性将其作为数字PCR中的反应室对于准确的实现起始DNA模板的绝对定量是十分关键的。在数字PCR
，在对反应体系进行PCR扩增处理前需要对其进行微滴化处理，其中，氟化油由于具有良好的生物惰性以及具有溶解氧的能力，被广泛作为连续相应用于液滴微流控中。
[0003]微滴式数字PCR的关键在于维持油包水液滴的稳定性。根据油包水原理，油水两相液体在特定条件下进行混合，将含有核酸分子的反应体系分为数个纳升级大小均一的油包水微液滴，而从热力学观点来看，油包水液滴天然是一个不稳定的体系，液滴只是相对的、暂时稳定的体系，其不稳定性主要体现在液滴的破碎、聚集和融合。尤其是PCR扩增，高低温循环，液滴更加容易出现破碎和融合。因此，为了确保油包水微液滴的稳定性，需要在氟化油中加入表面活性剂来调节油水界面表面张力的大小来稳定液滴。
[0004]目前最常见的PCR检测用表面活性剂为聚乙二醇（PEG），聚乙二醇（PEG）和全氟聚醚类树脂（PFPE）合成含氟表面活性剂PEG
‑
PFPE2，该表面活性剂可以显著提升常温下生成液滴的稳定性。但是PEG
‑
PFPE2中的PEG分子具有一定的疏水性并且对温度变化较为敏感，生成的液滴在进行PCR热循环的过程中容易发生破裂，并且液滴之间容易发生小分子转移，会影响最终的检测结果，因此，需要开发一种性能更优异的PCR检测用表面活性剂，使其生成的微液滴更稳定，避免融合破碎的问题出现。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中，在数字PCR
，通过直接计数的方法实现起始DNA模板的绝对定量的检测过程中，在对样品进行PCR扩增处理前，采用微流控或微滴化方法对样品进行微滴化处理，难以将含有核酸分子的样品分为成千上万个纳升级大小均一，稳定性好和表面张力适中的油包水微液滴，微液滴会聚集趋于融合，微液滴在进行PCR热循环的过程
中容易发生破裂，并且液滴之间容易发生小分子转移，会影响最终的检测结果，因此难以准确实现DNA模板的绝对定量的技术问题，本专利技术第一方面公开了具有式I所示结构特征的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂，其结构如下，n为正整数，n=1
‑
43。
[0006]在本专利技术的一些实施方式中，所述全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将式II的全氟聚醚进行酰氯化反应，制得式III的酰化全氟聚醚，所述全氟聚醚的平均分子量为2500
‑
7000，n为正整数，n=1
‑
43；步骤二：将酰化全氟聚醚与（2
‑
（1，3
‑
二羟基丙基
‑2‑
氨基）
‑2‑
羟甲基丙烷
‑
1，3
‑
二醇）反应，制备得到式I中的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂；在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤一中式II的全氟聚醚进行酰氯化反应的具体步骤包括：将式II的全氟聚醚，加入氟油溶解，再加入氯化亚砜，在30
‑
80
°
C温度条件下进行酰氯化反应10
‑
15h；在本专利技术的一些实施方式中，所述酰氯化反应后还包括如下步骤：冷却至室温，依次经过减压蒸馏、抽真空处理除去溶剂和氯化亚砜，然后进行柱层析萃取，制得酰化全氟聚醚；在本专利技术的一些实施方式中，所述步骤二的具体步骤包括：向酰化全氟聚醚中加入反应溶剂，再加入（2
‑
（1，3
‑
二羟基丙基
‑2‑
氨基）
‑2‑
羟甲基丙烷
‑
1，3
‑
二醇）反应，在55
‑
65
°
C下搅拌回流反应13
‑
18h，依次经抽真空处理、分液处理以除去未反应的（2
‑
（1，3
‑
二羟基丙基
‑2‑
氨基）
‑2‑
羟甲基丙烷
‑
1，3
‑
二醇）、减压蒸发除去溶剂后进行柱层析萃取，制备得到全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂；在本专利技术的一些实施方式中，所述全氟聚醚与氯化亚砜的摩尔比为0.04
‑
0.1：1；在本专利技术的一些实施方式中，所述酰化全氟聚醚与（2
‑
（1，3
‑
二羟基丙基
‑2‑
氨
基）
‑2‑
羟甲基丙烷
‑
1，3
‑
二醇）的质量比为0.01
‑
0.05；在本专利技术的一些实施方式中，所述反应溶剂为2
‑
（三氟甲基）
‑3‑
乙氧基十二氟己烷和二甲基亚砜的复配，所述2
‑
（三氟甲基）
‑3‑
乙氧基十二氟己烷和二甲基亚砜的体积比为2.5
‑
5：1；本专利技术第二方面公开了一种氟化油，其包括质量百分浓度为1%
‑
5%的上述全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂。
[0007]在本专利技术的一些实施方式中，所述氟化油中的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂分子间通过氢键结合，形成式IV链状结构：在本专利技术的一些实施方式中，所述（2
‑
（1，3
‑
二羟基丙基
‑2‑
氨基）
‑2‑
羟甲基丙烷
‑
1，3
‑
二醇）的结构式如结构式V所示：本专利技术第三方面公开了一种全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂在微流控液滴生成中的应用。
[0008]与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：本专利技术将全氟聚醚与（2
‑
（1，3
‑
二羟基丙基
‑2‑
氨基）
‑2‑
羟甲基丙烷
‑
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.具有式I所示结构特征的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂，其结构如下：n为正整数，n=1
‑
43。2.权利要求1所述的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：将式II的全氟聚醚进行酰氯化反应，制得式III的酰化全氟聚醚，所述全氟聚醚的平均分子量为2500
‑
7000，n为正整数，n=1
‑
43；步骤二：将酰化全氟聚醚与（2
‑
（1，3
‑
二羟基丙基
‑2‑
氨基）
‑2‑
羟甲基丙烷
‑
1，3
‑
二醇）反应，制备得到式I中的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂。3.根据权利要求2所述的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述步骤一中式II的全氟聚醚进行酰氯化反应的具体步骤包括：将式II的全氟聚醚，加入氟油溶解，再加入氯化亚砜，在30
‑
80
°
C温度条件下进行酰氯化反应10
‑
15h。4.根据权利要求3所述的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述酰氯化反应后还包括如下步骤：冷却至室温，依次经过减压蒸馏、抽真空处理除去溶剂和氯化亚砜，然后进行柱层析萃取，制得酰化全氟聚醚。5.根据权利要求2所述的全氟聚醚型氟碳二醇表面活性剂的制备方法，其特征在于，所述步骤二的具体步骤包括：向酰化全氟聚醚中加入反应溶剂，再加入（2
‑
（1，3
‑
二羟基丙基
‑2‑
氨基）
‑2‑
羟甲基丙烷
‑
1，3
‑
二醇）反应，在55

【专利技术属性】
技术研发人员：尚午，张毅良，韩斌，谭杰，于淑慧，
申请(专利权)人：南京普济生物有限公司，
类型：发明
国别省市：