一种检测CCL1的试剂盒及方法技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，具体涉及一种检测CCL1的试剂盒及方法，所述试剂盒包含包被有捕获抗体的磁珠、偶联有第一标记物的CCL1检测抗体、偶联有第二标记物的β

【技术实现步骤摘要】
一种检测CCL1的试剂盒及方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体涉及一种检测CCL1的试剂盒及方法。

技术介绍

[0002]CC趋化因子配体1(Chemokine(C
‑
C motif)ligand 1，CCL1)又称为I
‑
309，是一种由活化的人T淋巴细胞、单核细胞和内皮细胞等分泌的小糖蛋白，存在于人类第17号染色体上的大量CC趋化因子簇中。CCL1与细胞表面CC趋化因子受体8(Chemokine(C
‑
C motif)receptor 8，CCR8)相互作用，在免疫调节和炎症过程中发挥核心作用。
[0003]CCL1作为一种较强的化学吸引剂，主要在炎症性疾病中参与巨噬细胞和淋巴细胞募集和激活，包括特应性皮炎、过敏性哮喘、1型糖尿病、肺纤维化和实验性自身免疫性脑脊髓炎等。例如，在过敏性哮喘的发病机制中，CCL1能够趋化和招募CCR8+炎性细胞，从而主导哮喘气道中辅助型T细胞2型(T helper 2，Th2)炎症反应。哮喘患者支气管肺泡灌洗液中的CCL1浓度增加，与淋巴细胞数量的增多有关。CCL1水平则反映了哮喘气道炎症的严重程度，可作为治疗药物研究的切入点。在特应性皮炎的损伤期，CCL1水平显著升高，将T细胞和朗格汉斯型树突细胞募集到皮肤炎症部位从而放大免疫反应。通过对患者组织液及血清中CCL1含量进行监测，有助于探究其在特应性皮炎发病中的意义。在肺纤维化的发展进程中，慢性肺损伤导致肺泡巨噬细胞和T细胞产生大量的CCL1，CCL1与成纤维细胞膜上的自分泌生长因子受体(Autocrine motility factor receptor，AMFR)相结合，引起AMFR磷酸化，促进成纤维细胞内促纤维化蛋白合成，产生肺纤维化。CCL1作为肺纤维化发生发展的特异性标志物，为肺纤维化治疗及药物开发提供了新的视角。
[0004]此外，CCL1参与了肿瘤发展，包括胃癌、乳腺癌、结直肠癌、转移性脑癌和转移性肝癌等。在肿瘤微环境中，肿瘤干细胞、癌症相关成纤维细胞(Carcinoma
‑
associated fibroblasts，CAF)和肿瘤相关巨噬细胞(Tumor
‑
associated macrophages，TAM)分泌CCL1，结合癌细胞表面的CCR8，引起癌细胞的增殖和迁移。它还通过激活内皮细胞上的CCR8受体诱导血管生成。CCL1的另一个重要功能是将CD4+T细胞转化为调节性T细胞(Regulatory T cells，Treg)并将其募集到肿瘤生态位。CCL1/CCR8信号轴作为一种潜在的肿瘤免疫靶点，引起了世界范围内的关注。
[0005]目前，临床上对CCL1的检测方法主要包括化学发光法(Chemiluminescence analysis，CLIA)和酶联免疫吸附法(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)。CLIA的发光过程较短，荧光背景的本底较高，存在检测精度不高的问题。ELISA需要手动加样和洗板，耗时较长，受到操作人员手法不同的影响，实验结果也存在差异。此外，CLIA和ELISA方法只能达到皮克级别的检测水平，灵敏度均较低。
[0006]因此，开发一种全自动化、分析灵敏度更高、背景信号干扰较少且线性范围较宽的CCL1检测试剂盒具有广阔的应用前景。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供一种检测CCL1的试剂盒，其具有灵敏度高、背景信号干扰较少且线性范围较宽的优点。
[0008]为解决上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：
[0009]一种检测CCL1的试剂盒，所述试剂盒包含包被有捕获抗体的磁珠、偶联有第一标记物的CCL1检测抗体、偶联有第二标记物的β
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半乳糖苷酶、酶反应发光底物和CCL1标准品；所述包被有捕获抗体的磁珠中的捕获抗体用于与CCL1抗原特异性结合；所述偶联有第一标记物的CCL1检测抗体中的第一标记物用于与偶联有第二标记物的β
‑
半乳糖苷酶中的第二标记物连接，所述CCL1检测抗体用于与CCL1抗原特异性结合。本专利技术还提供了所述检测CCL1的试剂盒的制备方法。
[0010]本专利技术还提供了所述试剂盒在制备疾病检测产品中的用途。
[0011]本专利技术还提供了所述试剂盒检测CCL1的方法，所述方法为使用所述试剂盒采用免疫荧光二步法检测CCL1；所述方法为非疾病诊断方法。
[0012]此外，本专利技术利用酶联免疫吸附实验双抗体夹心法的原理，并结合了SIMOA(Single Molecular Array)单分子免疫阵列分析技术，能够在飞升大小的微孔中捕获单个分子，允许单个磁珠信号的数字化读取，并将数字化信号转换成为待测分子浓度，大大提高检测的灵敏度。
[0013]综上所述，本专利技术公开了一种检测CCL1的试剂盒及方法，并且获得以下有益效果：
[0014]本专利技术提供的试剂盒具有所需样本体积小、检测结果准确、检测灵敏度高、特异性好、线性范围宽、重复性好、检测时间短、并方便用于全自动检测仪器等优点，克服了现有免疫检测技术中存在的很多缺点。易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景。
[0015]本专利技术的有益效果还包括：
[0016]1、本专利技术优化了偶联有第二标记物的β
‑
半乳糖苷酶的工作浓度，为50
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250pM，在最低检测限、定量下限、定量上限、以及检测动态范围等参数上表现出优越的效果；特别是优选150pM，效果更佳。
[0017]2、本专利技术优化了偶联有第一标记物的CCL1检测抗体的工作浓度，为0.2
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1.2μg/mL，在信噪比、试剂盒的最低检测限(LOD)、以及检测的动态范围等参数上表现出优越的效果；特别是优选0.5μg/mL，效果更佳。
[0018]3、本专利技术优化了偶联捕获抗体的磁珠和辅助磁珠的混合比例，为7:3
‑
3:7，在最低检测限等参数上表现出优越的结果，特别是优选3:7，效果更佳。
[0019]4、本专利技术优化了在检测过程中捕获抗体、待测物、检测抗体、以及偶联有第二标记物的β
‑
半乳糖苷酶的孵育顺序和孵育时间。
[0020]5、本专利技术反应室体积为50fL，极小的反应体系可以降低背景噪音和信号散射，使得本专利技术比现有的常规ELISA方法的检测灵敏度平均高1000倍以上，可以检测非常低浓度的CCL1，所需样本含量少，可以节约珍贵样本，减少基质效应。
[0021]6、与本专利技术相应的检测分析仪器自动化完成稀释、混合、洗涤、孵育以及结果的读出和分析，实现从样本到结果一站式检测，不依赖工作人员，保证结果的重复性和精准性。
[0022]7、与本专利技术对应的SIMOA检测技术可以针对低浓度和高浓度样品采用数字检测和模拟检测两种不同的分析方式，提高了检测动态范围。
附图说明
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种检测CCL1的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含包被有捕获抗体的磁珠、偶联有第一标记物的CCL1检测抗体、偶联有第二标记物的β
‑
半乳糖苷酶、酶反应发光底物和CCL1标准品；所述包被有捕获抗体的磁珠中的捕获抗体用于与CCL1抗原特异性结合；所述偶联有第一标记物的CCL1检测抗体中的第一标记物用于与偶联有第二标记物的β
‑
半乳糖苷酶中的第二标记物连接，所述CCL1检测抗体用于与CCL1抗原特异性结合。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体为能与人CCL1抗原特异性结合的抗体；和/或，所述偶联有第一标记物的CCL1检测抗体为能与CCL1抗原特异性结合的抗体；优选的，所述捕获抗体和偶联有第一标记物的CCL1检测抗体的抗体种类为单克隆抗体；优选的，所述捕获抗体和偶联有第一标记物的CCL1检测抗体与CCL1抗原的亲和力分别满足解离常数KD＜10
‑9M。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述偶联有第一标记物的CCL1检测抗体中第一标记物为生物素或生物素衍生物；优选的，所述生物素衍生物为NHS
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PEG4
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Biotin；和/或，偶联有第二标记物的β
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半乳糖苷酶第二标记物为亲和素。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含样品稀释液和质控品。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含辅助磁珠；优选的，所述包被有捕获抗体的磁珠与所述辅助磁珠为混合试剂；优选的，所述混合试剂中包被有捕获抗体的磁珠与所述辅助磁珠的比例为7:3
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3:7；更优选的，所述包被有捕获抗体的磁珠与所述辅助磁珠的比例为3:7。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述包被有捕获抗体的磁珠为化学基团修饰的磁珠；所述化学基团为琥珀酰亚胺酯基、磺酰...

【专利技术属性】
技术研发人员：李倩，欧莹，韩峻松，李曼婧，徐祎春，
申请(专利权)人：上海生物芯片有限公司，
类型：发明
国别省市：