一种i-CS/HAp-NK复合体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于材料合成和生物医药技术领域，具体涉及一种i

【技术实现步骤摘要】
一种i
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CS/HAp
‑
NK复合体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于材料合成和生物医药
，具体涉及一种i
‑
CS/HAp
‑
NK复合体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]公开该
技术介绍
部分的信息仅仅旨在增加对本专利技术的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
[0003]近年来,肿瘤发病率呈现持续上升的态势,死亡率居高不下。临床上一般采用包括手术治疗、放疗、化疗等的综合治疗方案。随着对癌症发病机制的深入了解，免疫治疗已成为肿瘤综合治疗的重要手段之一。目前，过继免疫细胞治疗、免疫检查点分子等多种免疫治疗方法在临床研究得到肯定，成为肿瘤治疗有潜力的新领域。
[0004]自然杀伤（Natural killer，NK）细胞是一种很有前途的癌症免疫治疗工具。NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分，也是肿瘤免疫监测的关键。NK细胞通过细胞毒途径和产生细胞因子直接杀伤肿瘤细胞，杀伤作用更快更强，产生持续的抗肿瘤免疫反应。肿瘤中低氧、低营养的微环境导致NK细胞功能耗竭、数目减少，与肿瘤的发展密切相关。目前多数临床研究将NK细胞免疫疗法集中于血液瘤，而在实体瘤临床研究中NK细胞过继转输治疗效果并不理想。因此，开发一种能够提升肿瘤微环境中NK细胞存活能力和效应功能的策略和方案将具有重要的临床应用价值。
[0005]NK细胞的效应功能依赖于NK细胞活化信号和抑制信号之间的平衡。活化受体是调节NK细胞功能的关键因素，其中NKG2D和4
‑
1BB是NK细胞上主要的活化受体之一。细胞因子也在NK细胞激活、成熟和增殖中发挥重要作用，例如，IL
‑
21可以促进NK细胞的激活，IL
‑
2用于维持NK细胞的存活。因此，基于NK细胞表面的活化性受体和细胞因子设计联合激活NK细胞有望为实体瘤治疗提供新策略。

技术实现思路

[0006]为了解决现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种i
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CS/HAp
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NK复合体及其制备方法和应用。本专利技术基于羟基磷灰石纳米线的细胞因子吸附能力和抗体结合性能，联合温敏水凝胶在体内的缓释优势，制备了一种可实现NK细胞缓释、激活的i
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CS/HAp
‑
NK复合物，体内外实验证实具有良好的抗肿瘤能力，有望为应用于实体肿瘤的治疗。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术是通过如下的技术方案来实现：第一方面，本专利技术提供了一种i
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CS/HAp
‑
NK复合体的制备方法，包括以下步骤：分别利用细胞因子和抗体修饰羟基磷灰石纳米线，得到细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线；将细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线按质量比1:1
‑
3混合，与NK细胞共培养36
‑
60 h，离心后使用PBS重悬获得沉淀，与温敏水凝胶溶液混
匀，置于36
‑
37℃，得到i
‑
CS/HAp
‑
NK复合体。
[0008]第二方面，本专利技术提供了一种i
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CS/HAp
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NK复合体，由上述i
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CS/HAp
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NK复合体的制备方法获得。
[0009]第三方面，本专利技术提供了上述i
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CS/HAp
‑
NK复合体在制备治疗肿瘤药物中的应用。
[0010]上述本专利技术的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：（1）本专利技术提供的i
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CS/HAp
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NK复合体可实现NK细胞缓释，促进NK细胞的活化水平和功能效应，体内外实验证实具有良好的抗肿瘤能力，有望为应用于实体肿瘤的治疗；（2）温敏水凝胶在低温下保持液态，在人体体温下转变为固态，可以实现对NK细胞的有效包裹；（3）羟基磷灰石纳米线可以物理吸附细胞因子，从而实现细胞因子的释放，促进NK细胞活化；经过氨基化处理后，羟基磷灰石纳米线可以通过氨基
‑
羧基作用与抗体稳定连接，调节NK细胞功能。
附图说明
[0011]构成本专利技术的一部分的说明书附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。
[0012]图1为实施例1中温敏水凝胶冷冻干燥后的扫描电镜图（A）和在不同温度下的宏观照片（B）；图2为实施例1中羟基磷灰石纳米线的扫描电镜图；图3为实施例1中羟基磷灰石纳米线（i）、氨基修饰的羟基磷灰石纳米线（ii）、抗体α
‑
NKG2D和α
‑4‑
1BB修饰的羟基磷灰石纳米线（iii）的红外谱图；图4为实施例1中细胞因子白细胞介素
‑
2、白细胞介素
‑
21修饰的羟基磷灰石纳米线释放白细胞介素
‑
2（A）、白细胞介素
‑
21（B）的浓度时间曲线图和HAp B释放IgG（C）的浓度时间曲线图；图5为实施例1中羟基磷灰石与自然杀伤细胞的共聚焦结果图；图6为实施例1中自然杀伤细胞细胞凋亡水平图；图7为实施例1中自然杀伤细胞活/死染色结果图；图8为实施例1中自然杀伤细胞释放数量
‑
时间曲线图；图9为实施例1中用于表明自然杀伤细胞活化水平的CD69（A）和用于表明自然杀伤细胞效应功能的干扰素γ（B）、穿孔素（C）、颗粒酶B（D）的含量对比图；图10为实施例1中肿瘤抑制实验的各组小鼠第七天和第十四天时的活体自发光图像；图11为实施例1中肿瘤抑制实验的各组小鼠第七天（A）和第十四天（B）时的肿瘤负荷图；图12为实施例1中肿瘤抑制实验的指标对比图，其中，A为肿瘤浸润自然杀伤细胞比例对比图，B为干扰素γ表达对比图，C为CD69表达对比图，D为穿孔素表达对比图，E为Ki67表达对比图，F为颗粒酶B表达对比图。
具体实施方式
[0013]应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本专利技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属
的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0014]需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本专利技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
[0015]名词解释：PBS溶液为磷酸缓冲盐溶液，NK细胞为自然杀伤细胞，IL
‑
2为白细胞介素
‑
2，IL
‑
21为白细胞介素
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种i
‑
CS/HAp
‑
NK复合体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：分别利用细胞因子和抗体修饰羟基磷灰石纳米线，得到细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线；将细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线和抗体修饰的羟基磷灰石纳米线按质量比1:1
‑
3混合，与NK细胞共培养36
‑
60 h，离心后使用PBS重悬获得沉淀，与温敏水凝胶溶液混匀，置于36
‑
37℃，得到i
‑
CS/HAp
‑
NK复合体。2.如权利要求1所述的i
‑
CS/HAp
‑
NK复合体的制备方法，其特征在于，所述羟基磷灰石纳米线的制备方法为：将NaOH、CaCl2和NaH2PO4·
2H2O依次加入到水和乙醇的混合物中，加热，冷却到室温后离心得到所述羟基磷灰石纳米线。3.如权利要求2所述的i
‑
CS/HAp
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NK复合体的制备方法，其特征在于，NaOH的质量为0.3
‑
0.8g，CaCl2的质量为0.1
‑
0.2g，NaH2PO4·
2H2O的质量为0.15
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0.3g；加热温度为200
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250℃，加热时间为36
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60h。4.如权利要求1所述的i
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CS/HAp
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NK复合体的制备方法，其特征在于，所述细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线的制备方法为：将羟基磷灰石纳米线用PBS溶液重悬，加入细胞因子后，置于四度摇床10
‑
14h，离心重悬后得到细胞因子修饰的羟基磷灰石纳米线；所述细胞因子为IL
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2、IL
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21中的一种或多种。5.如权利要求1所述的i
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CS/HAp
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NK复合体的制备方法，其特征在于，所述抗体修饰的羟基磷灰石纳米线的制...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁晓红，焦德雁，桑元华，郝敏，马春红，高立芬，李春阳，岳学田，武专昌，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：