一种BVDV表位基因疫苗的构建方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种BVDV表位基因疫苗的构建方法及其应用。它是从NCBI上获得BVDV

【技术实现步骤摘要】
一种BVDV表位基因疫苗的构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因生物工程领域，涉及BVDV C、NS3、E0及E2基因的优势B/T细胞表位的预测与设计合成，构建重组真核质粒GV658载体的方法，具体说，是一种利用生物信息学获得BVDV基因表位预测序列AKK与E0、E2基因重组真核载体构建的方法及应用。

技术介绍

[0002]牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是黄病毒科瘟病毒属单股正链RNA病毒，可引起猪、牛、羊等多种动物的腹泻/黏膜病，给世界各地的肉牛和乳制品行业造成了重大的经济损失。目前，疫苗接种是预防该病的主要措施，国内外大多数的灭活苗和弱毒苗均存在排散病毒、病毒返强的风险。而表位疫苗具有安全性好、保护力强和应答类型可调控等优点。E2基因是主要的保护性抗原，能够诱导机体产生中和抗体并保护牛免受BVDV攻击，而且是BVDV的受体结合基因，负责病毒进入宿主细胞。E0基因含有BVDV的主要抗原表位，可以诱导保护性免疫应答，其基因序列高度保守，可以作为BVDV基因工程疫苗和免疫诊断的合适候选抗原；C基因和NS3基因均为含有免疫原性的基因质，可用于疫苗研发和抗体制备。基于以上种种原因，表位疫苗的设计及研发迫在眉睫。

技术实现思路

[0003]本专利技术所要解决的技术问题是，通过各种前沿的在线生物预测软件对C、E0、E2和NS3基因进行表位筛选，连接肽将所筛选的表位进行连接，获得一条具有高免疫原性的肽段（命名为AKK，表位预测基因）。使其进入机体后首先启动自身的细胞和体液免疫功能。将AKK、E0和E2基因分别克隆至载体GV658，使AKK与E0、E2蛋白分别发挥各自免疫功效，实现多基因的协同免疫效应，实现对BVDV的免疫保护作用，籍此为BVD表位疫苗研究提供新的研究思路和方法。
[0004]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案是：一种对牛病毒性腹泻病毒BVDV具有免疫保护作用的表位基因疫苗，命名为AKK，属于表位预测基因。
[0005]本专利技术进一步公开了利用生物信息学获得BVDV基因表位预测序列AKK与E0、E2基因重组真核载体构建的方法，包括以下步骤：1）从NCBI上查找BVDV
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1的E0、E2、C、NS3氨基酸序列，登录号为NCBI参考序列：C蛋白序列NP_776260.1，E0蛋白序列NP_776261.1，E2蛋白序列NP_776263.1，NS3蛋白NP_776267.1，选取蛋白CDS区的氨基酸序列。使用在线预测工具BepiPred、ABCPred分别预测E0、E2、C、NS3蛋白的B细胞表位；使用在线预测工具IEBD分别预测E0、E2、C、NS3蛋白的CTL细胞表位、TH细胞表位。将上述获得的B细胞表位和T细胞表位序列串联，相同类型细胞表位间选择柔性肽GGGGS连接，不同类型细胞表位间选择刚性短肽GPLS连接，串联序列末端添加Flag标签以便蛋白检测，连接获得新肽段命名为AKK。利用生物学在线软件SOPMA、VaxiJen、ExPASY、I
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TASSER分析其二级结构、抗原性、稳定性及三级结构。
[0006]2）AKK
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E0
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E2基因、AKK基因、E0基因、E2基因PCR扩增：以AKK
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F SEQ ID NO.1和E2
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R ID NO.6序列扩增AKK
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E0
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E2基因；以AKK
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F SEQ ID NO.1和AKK
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R SEQ ID NO.2序列扩增AKK基因；以E0
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F SEQ ID NO.3和E0
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R SEQ ID NO.4序列扩增E0基因；以E2
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F SEQ ID NO.5和E2
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R SEQ ID NO.6序列扩增E2基因。
[0007]3）将获得的目的基因克隆到pMD
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19
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T载体中，再利用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别对质粒pMD
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AKK
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E0
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E2SEQ ID NO.7、pMD
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AKKSEQ ID NO.8、pMD
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E0SEQ ID NO.9、pMD
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E2SEQ ID NO.10及GV658载体进行双酶切，T4 DNA连接酶16℃连接过夜后分别获得重组质粒GV658
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AKK
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E0
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E2、GV658
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AKK、GV658
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E0及GV658
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E2。将上述重组质粒和GV658分别转化Top10感受态细胞，通过氨苄霉素抗性培养基筛选阳性菌株。
[0008]4）按照天根质粒大提（无内毒素）试剂盒提取质粒，重组真核质粒转染MDBK细胞可见绿色荧光；经Western blot验证真核表达载体在细胞水平上获得E0、E2融合表达基因，实现了AKK与E0
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E2基因共表达；RT
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PCR验证成功扩增目的基因片段；CCK
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8验证重组质粒对细胞有无毒性及损伤作用。
[0009]5）重组质粒免疫后，大鼠生长和脏器进行称重，病理切片观察各组大鼠脏器组织结构有无明显病理变化；ELISA检测血清抗体水平；流式细胞术检测CD3+、CD4+和CD8+细胞比例。
[0010]本专利技术更进一步公开了对牛病毒性腹泻病毒BVDV具有免疫保护作用的表位基因疫苗在制备用于疫苗研发和抗体制备方面的应用。实验结果显示：ELISA检测AKK
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E0
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E2、AKK、E0、E2和PBS组抗体滴度分别为152.58μg/mL、133.13μg/mL、131.32μg/mL、127.22μg/mL、117.21μg/mL。各组疫苗AKK
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E0
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E2极显著高于PBS组（P<0.01），其中，AKK、E2显著高于PBS组（0.05<P<0.01），AKK
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E0
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E2组高于E0组（0.05<P<0.01），能引起机体体液免疫反应；流式细胞术检测CD3+、CD4+和CD8+细胞比例AKK
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E0
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E2、AKK、E0、E2组均极显著高于PBS组（P<0.01），AKK
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E0
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E2显著高于E0组（0.05<P<0.01），能引起机体细胞免疫反应；重组质粒疫苗能够显著激发大鼠免疫力。
[0011]上述利用生物信息学预测BVDV E0、E2、C、NS3基因表位，获得AKK基因序列。上述表位预测序列AKK与E0、E2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对牛病毒性腹泻病毒BVDV具有免疫保护作用的表位基因疫苗，命名为AKK。2.权利要求1所述对牛病毒性腹泻病毒BVDV具有免疫保护作用的表位基因疫苗AKK的构建方法，其特征在于包括以下步骤：通过生物信息学在线软件分析，获得了具备良好免疫原性的BVDV表位基因序列，根据SD大鼠偏好性密码子进行优化，获得大鼠体内高效表达的AKK基因序列；AKK
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E0
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E2基因、AKK基因、E0基因、E2基因PCR扩增：以AKK
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F SEQ ID NO.1和E2
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R ID NO.6序列扩增AKK
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E0
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E2基因；以AKK
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F SEQ ID NO.1和AKK
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R SEQ ID NO.2序列扩增AKK基因；以E0
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F SEQ ID NO.3和E0
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R SEQ ID NO.4序列扩增E0基因；以E2
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F SEQ ID NO.5和E2
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R SEQ ID NO.6序列扩增E2基因；将获得的目的基因克隆到pMD
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19
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T载体中，再利用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别对质粒pMD
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AKK
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E0
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E2、pMD
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AKK、pMD
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E0、pMD
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E2及GV658载体进行双酶切，T4 DNA连接酶16℃连接过夜后分别获得重组质粒GV658
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AKK
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E0
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E2、GV658
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AKK、GV658
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E0及GV658
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E2；将上述重组质粒和GV658分别转化Top10感受态细胞，通过氨苄霉素抗性培养基筛选阳性菌株；按照天根质粒大提（无...

【专利技术属性】
技术研发人员：金天明，赵微，陈婷，何敬文，扈立伟，任君，
申请(专利权)人：天津市农业科学院，
类型：发明
国别省市：