基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器、制备及应用制造技术

本发明专利技术涉及功能化磁性纳米材技术领域，提供了一种基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器、制备及应用，所述反应器制备方法包括：制备磁性氧化石墨烯，将金纳米颗粒固载在磁性氧化石墨烯上；利用自组装反应合成顶点含有巯基的DNA四面体；利用Au、S之间的共价结合将DNA四面体修饰在金纳米颗粒上；最后将胰蛋白酶固载在DNA四面体上，得到固定化酶反应器。本发明专利技术固定化酶反应器具有较大的比表面积，可有效提高胰蛋白酶的固载量；磁性基质便于将固定化酶反应器快速分离回收，实现酶的回收及反复利用；通过控制DNA四面体的尺寸有效控制酶之间的间距，有效避免由于酶的自消化引起的酶活性损失，提高固定化酶的重复使用寿命和酶解效率。提高固定化酶的重复使用寿命和酶解效率。提高固定化酶的重复使用寿命和酶解效率。

【技术实现步骤摘要】
基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器、制备及应用


[0001]本专利技术涉及功能化磁性纳米材
，特别涉及一种基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器、制备及应用。

技术介绍

[0002]蛋白质高效快速酶切是Bottom
‑
up蛋白质组学策略中的重要一环，对于蛋白质的定性定量有着至关重要的影响。传统的蛋白质溶液酶切方法通常需要消耗十几个小时，极大的限制了实验过程中针对复杂生物样品的高通量预处理及分析,且游离蛋白酶的自切会引起样品复杂性增高。在近年来的研究中，固定化酶凭借显著缩短酶切时间、可重复利用等特性得以快速发展。酶与材料主要通过共价键、物理吸附、包埋或交联等方式连接起来。常见的固载基质包括磁性纳米颗粒、介孔材料、有机金属框架等。
[0003]磁性纳米粒子具有独特的磁学性质，与传统溶液酶切相比，磁性固定化酶反应器可以从酶切体系中快速分离，实现了酶的回收和重复利用，提供了经济高效的实验方案。但以磁性纳米颗粒作为固定化酶载体时仍存在一些不足，如磁性纳米颗粒较低的比表面积严重影响了酶的固载量、其在空气或酸性环境中易发生氧化，且磁性颗粒易团聚的特性影响了固定化酶反应器的活性以及分散效果。
[0004]针对上述缺陷，急需新的技术思路来提高酶切效率。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是克服现有技术的不足，提供了一种基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器、制备及应用，所述复合磁性固定化酶反应器以磁性纳米材料为基质，具有使用简便快速、可重复利用等特点，提供了一定的经济效益；且所述复合磁性固定化酶反应器可以通过控制DNA四面体的尺寸有效的控制胰蛋白酶之间的间距，从而有效的避免由于酶的自消化引起的酶活性损失，使得酶切效率显著提高，酶切时间大大缩短。
[0006]本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一方面，本专利技术提供了一种基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器，包括：磁性氧化石墨烯、固载在所述磁性氧化石墨烯上的金纳米颗粒、修饰在所述金纳米颗粒上的DNA四面体，以及固载在所述DNA四面体上的胰蛋白酶。
[0008]如上所述的任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述磁性氧化石墨烯的制备方法为：使用溶剂热法将四氧化三铁磁性纳米颗粒负载在氧化石墨烯上，四氧化三铁磁性纳米颗粒的粒径为100～500nm。
[0009]如上所述的任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，磁性纳米颗粒也可以为Fe、Co、Ni的金属氧化物，优选为四氧化三铁磁性纳米颗粒，Fe3O4的饱和磁化强度是几种金属氧化物中最高的，且Fe3O4磁性纳米粒子具有制备方法简单，原材料来源广泛、安全无毒、生物兼容性良好的优点。
[0010]如上所述的任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述DNA四面体由4
条DNA单链通过自组装反应的方式合成，每一条DNA单链包含22～80个脱氧核糖核苷酸单体；DNA单链的3
’
端或5
’
端具有功能基团，所述功能基团为巯基和羧基，其中巯基用于DNA四面体与磁性固定化酶反应器中的金纳米颗粒反应，羧基用于DNA四面体与胰蛋白酶结构中的氨基键合。
[0011]另一方面，本专利技术还提供了一种基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器的制备方法，，包括：通过溶剂热法制备磁性氧化石墨烯；将金纳米颗粒固载在磁性氧化石墨烯上；利用自组装反应合成顶点含有巯基的DNA四面体；利用Au、S之间的共价结合将DNA四面体修饰在金纳米颗粒上；通过羧基与氨基键合形成的共价键将胰蛋白酶固载在DNA四面体上，得到所述磁性固定化酶反应器。
[0012]如上所述的任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，所述方法具体包括：
[0013]S1、在氧化石墨烯表面负载四氧化三铁磁性纳米颗粒，得到产物I:Fe3O4@GO；
[0014]S2、以氧化石墨烯表面带负电的功能团为成核中心，利用还原金属盐溶液(如HAuCl4)使得金纳米颗粒在氧化石墨烯表面进行原位颗粒生长，得到产物II:Fe3O4@GO@AuNPs；
[0015]S3、利用Au、S之间的共价结合，将DNA四面体修饰在所述产物II中的金纳米颗粒上，得到产物III:Fe3O4@GO@AuNPs@DNA TET；
[0016]S4、通过DNA四面体的羧基与胰蛋白酶的氨基键合形成的共价键将胰蛋白酶固载在所述产物III的DNA四面体上，得到产物Ⅳ：Fe3O4@GO@AuNPs@DNA TET@Trypsin，即为所述磁性固定化酶反应器。
[0017]如上所述的任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，步骤S1中，产物I:Fe3O4@GO的制备方法为：
[0018]在六水合三氯化铁的乙二醇溶液中加入氧化石墨烯和无水乙酸钠，得分散液；将所述分散液超声至溶液均一，转移至高压反应釜中进行加热，加热温度为180～220℃，加热时间为8～12小时；反应产物冷却后洗涤即得产物I:Fe3O4@GO。
[0019]如上所述的任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，步骤S2中，产物II:Fe3O4@GO@AuNPs的制备方法为：
[0020]向60mg产物I:Fe3O4@GO中加入30～50ml超纯水后混匀，得到分散液；先后向分散液中加入2～4ml四氯金酸溶液和2～4ml柠檬酸钠溶液，搅拌10分钟后，在冰浴条件下加入2～4ml新配的NaBH4溶液，继续机械搅拌30～60分钟；将混合溶液静置于黑暗环境中16～24h，即得产物II:Fe3O4@GO@AuNPs。
[0021]如上所述的任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，步骤S3中，产物III:Fe3O4@GO@AuNPs@DNA TET的制备方法为：
[0022]向15mg产物II中加入DNA四面体溶液、TE缓冲液及一定量的氯化钠溶液，分散液置于4℃旋转孵育12～16h后得到产物III；DNA四面体由4条浓度为1umol/L DNA单链通过碱基互补配对自组装制得。
[0023]如上所述的任一可能的实现方式，进一步提供一种实现方式，步骤S4中，产物Ⅳ：Fe3O4@GO@AuNPs@DNA TET@Trypsin的制备方法为：
[0024]首先，向1mg产物III中加入EDC(即1
‑
乙基
‑
(3
‑
二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺)及NHS(即N
‑
羟基丁二酰亚胺)活化DNA四面体上的羧基，随后将活化后的产物III与蛋白酶溶
液于4℃
[0025]中旋转孵育12小时，即得所述产物Ⅳ：Fe3O4@GO@AuNPs@DNA TET@Trypsin。
[0026]再一方面，本专利技术还提供了一种上述的基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器的应用，所述固定化酶反应器用于蛋白质快速酶切；快速酶切步骤为：将所述的固定化酶反应器与变性后的蛋白样品进行混合孵育，酶切结束后通过外加磁体分离磁性材料与上清液。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器，其特征在于，所述磁性固定化酶反应器包括：磁性氧化石墨烯、固载在所述磁性氧化石墨烯上的金纳米颗粒、修饰在所述金纳米颗粒上的DNA四面体，以及固载在所述DNA四面体上的胰蛋白酶。2.如权利要求1所述的基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器，其特征在于，所述磁性氧化石墨烯的制备方法为：使用溶剂热法将四氧化三铁磁性纳米颗粒负载在氧化石墨烯上，四氧化三铁磁性纳米颗粒的粒径为100～500nm。3.如权利要求1所述的基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器，其特征在于，所述DNA四面体由4条DNA单链通过自组装反应的方式合成，每一条DNA单链包含22～80个脱氧核糖核苷酸单体；DNA单链的3
’
端或5
’
端具有功能基团，所述功能基团为巯基和羧基，其中巯基用于DNA四面体与磁性固定化酶反应器中的金纳米颗粒反应，羧基用于DNA四面体与胰蛋白酶结构中的氨基键合。4.一种基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器的制备方法，其特征在于，所述方法包括：通过溶剂热法制备磁性氧化石墨烯；将金纳米颗粒固载在磁性氧化石墨烯上；利用自组装反应合成顶点含有巯基的DNA四面体；利用Au、S之间的共价结合将DNA四面体修饰在金纳米颗粒上；通过羧基与氨基键合形成的共价键将胰蛋白酶固载在DNA四面体上，得到所述磁性固定化酶反应器。5.如权利要求4所述的基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器的制备方法，其特征在于，所述方法具体包括：S1、在氧化石墨烯表面负载四氧化三铁磁性纳米颗粒，得到产物I:Fe3O4@GO；S2、以氧化石墨烯表面带负电的功能团为成核中心，利用还原金属盐溶液HAuCl4使得金纳米颗粒在氧化石墨烯表面进行原位颗粒生长，得到产物II:Fe3O4@GO@AuNPs；S3、利用Au、S之间的共价结合，将DNA四面体修饰在所述产物II中的金纳米颗粒上，得到产物III:Fe3O4@GO@AuNPs@DNA TET；S4、通过DNA四面体的羧基与胰蛋白酶的氨基键合形成的共价键将胰蛋白酶固载在所述产物III的DNA四面体上，得到产物Ⅳ：Fe3O4@GO@AuNPs@DNA TET@Trypsin，即为所述磁性固定化酶反应器。6.如权利要求5所述的基于DNA四面体的磁性固定化酶反应器的制备方法，其特征在于，步...

【专利技术属性】
技术研发人员：翟睿，方向，樊小雪，楚占营，朱曼曼，赵洋，米薇，龚晓云，江游，武利庆，戴新华，俞晓平，
申请(专利权)人：中国计量科学研究院，
类型：发明
国别省市：