一种固定化脂肪酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种固定化脂肪酶及其应用。本发明专利技术公开的固定化脂肪酶是通过在缓冲溶液中加入游离脂肪酶、固定化载体、稳定剂和生物来源的共固定化剂，在适合所述固定化载体吸附所述游离脂肪酶的条件下搅拌，然后将所得的溶液经过滤、清洗和干燥后制得。本发明专利技术所用的生物来源的共固定化剂与脂肪酶的相容性好且有利于脂肪酶在体系中分散，提高了脂肪酶吸附效率，所用的稳定剂能保证脂肪酶的活性。本发明专利技术公开的固定化脂肪酶应用于维生素A棕榈酸酯合成中转化率高，有很大的工业化应用的潜力。有很大的工业化应用的潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种固定化脂肪酶及其应用


[0001]本专利技术属于酶固定化领域，涉及一种固定化脂肪酶及其应用，尤其是在维生素A棕榈酸酯制备中的应用。

技术介绍

[0002]脂肪酶存在于自然界各种动植物和微生物体内，可催化水解、酯化、酰胺化等化学反应。同时其在有机相也表现出高效的催化活性，这拓宽了该酶的应用领域。脂肪酶经过固定化之后有利于酶重复使用，进而降低脂肪酶的使用成本。因此脂肪酶的固定化效果是影响脂肪酶酶活性与回用次数的重要因素。影响脂肪酶固定化的最重要因素是固定化过程中酶分子更倾向于聚集很难以单分子层的形式存在而导致固定化过程大部分酶分子没有与载体结合，从而影响固定化效率。另一因素是固定化时间较长，在这一过程中蛋白质分子的结构易遭到破坏而影响酶的活性。
[0003]现有方法在固定化过程中加入了Triton X
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100等化学表面活性剂，从而使酶分子形成单分子层。但是由于Triton X
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100是一种醚类化合物，可能对蛋白质的分子结构有一定破坏作用。同时如何保证酶在固定化过程中的稳定性，目前研究较少。因此，开发出生物基表面活性剂和酶结构稳定剂是保证脂肪酶高效固定的必要条件。

技术实现思路

[0004]针对现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供一种高效固定化脂肪酶并表征其在维生素A棕榈酸酯合成中的应用。具体来说，本专利技术的固定化脂肪酶的制备方法中添加微藻来源的生物基共固定化剂和葡萄苷物质，分别提高了酶在体系中的分散均匀度和维持了酶结构稳定性，从而提高了脂肪酶的固定化效率和脂肪酶活性，本专利技术的操作简单，将本专利技术的固定化脂肪酶应用于维生素A棕榈酸酯合成反应中反应转化率高。
[0005]为实现上述目的，在一个方面，本专利技术提供一种固定化脂肪酶，其通过在缓冲溶液中加入游离脂肪酶、固定化载体、稳定剂和生物来源的共固定化剂，在适合所述固定化载体吸附所述游离脂肪酶的条件下搅拌，然后将所得的溶液经过滤、清洗和干燥后制得。
[0006]在本专利技术的一个实施方案中，上述固定化脂肪酶中，所述游离脂肪酶选自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)来源游离脂肪酶、柔毛腐质霉(Humicola Lanuginosa)来源游离脂肪酶和南极假丝酵母(Candida antarctica)来源游离脂肪酶的一种或多种，优选米黑根毛霉来源游离脂肪酶。这些游离脂肪酶可以是商购的，也可以是自制的。在本领域中，这些游离脂肪酶的制备方法是公知的，可以采用任何一种现有的方法进行制备，例如可以通过如下方法制备：将菌液接种到含基础盐的培养基中进行发酵，在溶氧上升时，流加甘油，间歇补料酵母膏和蛋白胨，控制溶氧和pH，发酵结束后离心收集上清并冻干。
[0007]在本专利技术的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述共固定化剂来源于微藻藻油纯化后的极性糖脂混合物，其制备方法包括如下步骤:
[0008](1)取微藻生物质加入有机溶剂，于20～50℃(例如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、
45℃和50℃，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选35～50℃条件下混合均匀，调节体系压力至10～40MPa(例如10MPa、20MPa、30MPa和40MPa，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选30～40MPa，搅拌2～5h(例如2h、3h、4h和5h)，优选3～5h，使得微藻生物质破碎；搅拌完成后离心取上清液，离心转速为5000～10000rpm(例如5000rpm、6000rpm、7000rpm、8000rpm、9000rpm和10000rpm，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选8000～10000rpm，得到粗藻油；将所述上清于3～10KPa，优选3～8KPa、45
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55℃条件下脱除溶剂，得到藻油固体；
[0009](2)将藻油固体经过硅胶柱分离，洗脱溶剂为正庚烷:异丙醇＝(4
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10):1(v/v)(例如4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1和10:1，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选(8～10):1；收集1CV(柱体积)至2～3CV(例如1至2CV，1至2.5CV和1至3CV)，优选1至2.5～3CV(柱体积)组分；将所得组分于3～10KPa(例如3KPa、4KPa、5KPa、6KPa、7KPa和8KPa，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选3～8KPa、45
‑
55℃条件下脱除溶剂后即为共固定化剂。
[0010]在本专利技术的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述共固定化剂的制备方法中，
[0011]步骤(1)中，所述微藻生物质为微藻干藻粉，优选选自螺旋藻干藻粉、小球藻干藻粉和三角褐指藻干藻粉中的一种或多种，更优选三角褐指藻干藻粉；和/或
[0012]步骤(1)中，所述有机溶剂选自甲醇、氯仿、正己烷中的一种或多种，优选甲醇；优选地，步骤(1)中，每克微藻生物质中加入有机溶剂的体积为5～10mL(例如5mL、6mL、7mL、8mL、9mL和10mL，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选8～10mL；和/或
[0013]步骤(2)中，所述藻油固体与所述硅胶的质量比为1:(40～100)(例如1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90和1:100，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选1:(40～70)；
[0014]硅胶柱的柱内径例如可以为72～100mm。
[0015]在本专利技术的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述稳定剂选自甲基葡萄糖苷、乙基葡萄糖苷和甘油葡萄糖苷中的一种或多种，优选甘油葡萄糖苷。
[0016]在本专利技术的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述固定化载体为吸附树脂，优选D3520、Duolite A568和Amberlite X.A.D 761材料中的一种或多种，更优选Duolite A568。
[0017]在本专利技术的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述缓冲溶液选自Tris
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盐酸缓冲液、Bis
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tris
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盐酸缓冲液中的一种或多种，优选Tris
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盐酸缓冲液；浓度为0.5～2.0mol/L(例如0.5mol/L、1mol/L、1.3mol/L、1.7mol/L、1.9mol/L和2.0mol/L，或这些数值中的任意二者之间的数值或范围)，优选0.5～1mo1/L；pH为5～8(例如5，6，7和8)，优选6～8。
[0018]在本专利技术的一个实施方案中，上述任一所述的固定化脂肪酶中，所述缓冲溶液的加入量为每克游离脂肪酶加入的缓冲溶液的体积为200～300mL(例如200mL、210mL、220mL、230mL、240mL、250mL、260mL，270mL、280mL、290mL和300mL)，优选250～300mL；所述共固定化剂与所述稳定剂在缓冲本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种固定化脂肪酶，其通过在缓冲溶液中加入游离脂肪酶、固定化载体、稳定剂和生物来源的共固定化剂，在适合所述固定化载体吸附所述游离脂肪酶的条件下搅拌，然后将所得的溶液经过滤、清洗和干燥后制得。2.根据权利要求1所述的固定化脂肪酶，其特征在于：所述游离脂肪酶选自米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)来源游离脂肪酶、柔毛腐质霉(Humicola Lanuginosa)来源游离脂肪酶和南极假丝酵母(Candida antarctica)来源游离脂肪酶的一种或多种。3.根据权利要求1或2所述的固定化脂肪酶，其特征在于：所述共固定化剂来源于微藻藻油纯化后的极性糖脂混合物，其制备方法包括如下步骤:(1)取微藻生物质加入有机溶剂，于20～50℃，体系压力10～40MPa的条件下搅拌，使得微藻生物质破碎；搅拌完成后离心，获得上清，即粗藻油；将所述上清脱除溶剂，得到藻油固体；(2)将藻油固体经过硅胶柱分离，洗脱溶剂为正庚烷:异丙醇＝(4～10):1(v/v)；收集1CV至2～3CV(柱体积)组分；将所得组分脱除溶剂后即为共固定化剂。4.根据权利要求3所述的固定化脂肪酶，其特征在于：所述共固定化剂的制备方法中，步骤(1)中，所述微藻生物质为微藻干藻粉；和/或步骤(1)中，所述有机溶剂选自甲醇、氯仿和正己烷中的一种或多种；和/或步骤(2)中，所述藻油固体与所述硅胶的质量比为1:(40～100)。5.根据权利要求1

【专利技术属性】
技术研发人员：姜君鹏，王竞辉，孔令晓，张光祥，孙烨，潘亚男，李兴华，
申请(专利权)人：万华化学集团股份有限公司，
类型：发明
国别省市：