一种二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备方法，是将二氧化锰微球完全溶解于硝酸钴的甲醇溶液中，再加入2

【技术实现步骤摘要】
一种二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备及应用


[0001]本专利技术涉及一种二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备方法，本专利技术同时涉及该二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球作为固定化酶载体用于制备固定化乙酰胆碱酯酶，本专利技术还涉及该固定化乙酰胆碱酯酶在筛选中药旋覆花中乙酰胆碱酯酶抑制剂的应用。

技术介绍

[0002]阿尔茨海默病 (AD)伴有记忆功能障碍、行为障碍和认知功能受损等症状。通过抑制乙酰胆碱酯酶活性来治疗AD的策略得到了胆碱能假说的支持，即AD的病理生理学与胆碱能神经传递功能缺陷有关，而胆碱能神经传递功能与乙酰胆碱 (ACh)、去甲肾上腺素、多巴胺和血清素有关。乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制剂可以防止神经递质的降解，因此ACh水平的增加有助于促进缺乏的胆碱能神经传递，进而达到治疗AD的目的。目前，大多数AChE抑制剂，他克林、多奈哌齐、利斯的明、加兰他敏和石杉碱甲都是旨在缓解AD症状的药物（J. L. Cummings, Neurobiol. Aging 21 (2000) 845
‑
861; R. M. Lane, S. G. Potkin, A. Enz, Int. J. Neuropsychopharmacol. 9 (2006) 101
‑
124）。
[0003]中药因具有多样的化学成分和较低的毒性作用，成为从中探索具有乙酰胆碱酯酶抑制活性药物及有效成分的重要来源，这也成为一种治疗阿尔兹海默症的重要手段（A. L. Harvey, Drug Discov. Today 13 (2008)894
‑
901; X. P. Kong, E. Y. L. Liu, Z. C. Chen, M. L. Xu, A. X. D. Yu, Q. Y. Wu, Y. J. Xia, R. Duan, T. T. X. Dong, K. W. K. Tsim,Molecules 24 (2019) 4567）。基于Ellman's反应，微孔板测定法，高效液相色谱法和薄层色谱法已被报道用于筛选AChE抑制剂。基于紫外分光光度计的Ellman's比色法的筛选原理为乙酰胆碱酯酶水解底物氯化乙酰硫代胆碱为硫代胆碱，硫代胆碱再与显色剂5,5'
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二硫代双（2
‑
硝基苯甲酸）（DTNB）反应生成在波长为412 nm处有特征吸收的化合物5
‑
硫
‑2‑
硝基苯甲酸（TNB）。通过向反应体系中加入待测样品，可以通过紫外分光光度计测定吸光度的增减量，进而间接测定待测样品对乙酰胆碱酯酶的抑制活性，从而达到筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的目的。此外，本专利技术中基于Ellman's反应，采用具有pH值和温度耐受性范围广，储存稳定性好和重复使用且容易储存等特点的固定化酶方法从中药中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂（A. F. L. Vilela, C. L. Cardoso, C. Mateo,Sensor. Actuat. B
‑
Chem. 278 (2019) 196
‑
201）。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一种二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备方法；本专利技术的另一目的是提供二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球作为载体在制备固定化乙酰胆碱酯酶的应用；本专利技术的再一目的是提供基于二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球制备的固定化乙酰胆碱酯酶在筛选中药旋覆花中乙酰胆碱酯酶抑制剂的应用。
[0005]二氧化锰具有比表面积大、吸附能力强、渗透性好、扩散路径短、稳定性好、活性
高、毒性低等独特性能。通过在其表面修饰ZIF
‑
67，因此具有出色的化学稳定性、高负载能力、合适的孔径等特性的二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球可作为一种新颖的酶固定化载体。固定化乙酰胆碱酯酶于二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球后，可应用于从中药旋覆花及其化合物中筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂。
[0006]一、二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备（1）制备二氧化锰微球：将高锰酸钾溶解于超纯水中，再加入盐酸，室温搅拌15~30 min；所得混合溶液转移到聚四氟乙烯的高压反应釜中，于100~130℃下反应5~8 h；反应结束后冷却至室温，离心，所得产物用乙醇和超纯水洗涤数次，干燥，得到二氧化锰微球（MnO2）；高锰酸钾与盐酸的摩尔比为1：1.5~1：3；高锰酸钾按1:30~1:50 g/ml的质量体积比溶解于超纯水中。
[0007]（2）制备二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球：将上述制得的二氧化锰微球完全溶解于六水合硝酸钴（Co(NO3)2·
6H2O）的甲醇溶液中，室温下磁力搅拌40~60 min，再加入2
‑
甲基咪唑的甲醇溶液，室温下磁力搅拌10~12h，离心，所得产物用甲醇和超纯水洗涤数次，干燥，得到二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球（MnO2‑
ZIF
‑
67）。二氧化锰微球按1:100~1:150 g/ml的质量体积比溶解于六水合硝酸钴的甲醇溶液中，二氧化锰微球与六水合硝酸钴的质量比为1：1.5~1：2.5；二氧化锰微球与2
‑
甲基咪唑的质量比为1：3~1：5。
[0008]图1为本专利技术二氧化锰微球和二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的扫描电子显微镜图和透射电子显微镜图。透射电镜和扫描电镜测试显示，所制备的二氧化锰微球具有明显的由纳米棒构成球形的结构（图1a和1b），二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球除了原有的结构，还在表面修饰了ZIF
‑
67（图1c和1d）。研究表明，在二氧化锰微球表面修饰ZIF
‑
67可以提高材料的比表面积，带负电的MnO2和带正电的ZIF
‑
67通过静电相互作用结合在一起，形成带正电的MnO2‑
ZIF
‑
67。AChE在pH高于其等电点（pI = 4.5）的环境中带负电，带负电的AChE有利于与带正电的MnO2‑
ZIF
‑
67进行静电相互作用，可实现乙酰胆碱酯酶的固定。
[0009]二、固定化乙酰胆碱酯酶的制备将二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球（MnO2‑
ZIF
‑
67）分散在磷酸盐缓冲液中，在剧烈摇动条件下向悬浮液中加入乙酰胆碱酯酶溶液，室温振摇1~5 h后，离心收集混合物，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即得固定化乙酰胆碱酯酶（MnO2‑
ZIF
‑
67 immobilized AChE）。将所得的固定化乙酰胆碱酯酶分散在磷酸盐缓冲液中，并在4℃下储存。固定化乙酰胆碱酯酶的制备流程图参见图2。
[0010]其中，磷酸盐缓冲液的pH值为7~11，乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为0.1~0.8 mg/mL。MnO2‑
ZIF
‑
67与乙酰胆碱酯酶的质量比为200：1~25：1。
[0011]图3为二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球固定化乙酰胆碱酯本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备方法，包括以下步骤：（1）制备二氧化锰微球：将高锰酸钾溶解于超纯水中，再加入盐酸，室温搅拌15~30 min；所得混合溶液转移到聚四氟乙烯的高压反应釜中，于100~130℃下反应5~8 h；反应结束后冷却至室温，离心，所得产物用乙醇和超纯水洗涤，干燥，得到二氧化锰微球；（2）制备二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球：将上述制得的二氧化锰微球完全溶解于六水合硝酸钴的甲醇溶液中，室温下磁力搅拌40~60 min，再加入2
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甲基咪唑的甲醇溶液，室温下磁力搅拌10~12h，离心，所得产物用甲醇和超纯水洗涤，干燥，得到二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球MnO2‑
ZIF
‑
67。2.如权利要求1所述一种二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，高锰酸钾与盐酸的摩尔比为1：1.5~1：3。3.如权利要求1所述一种二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，二氧化锰微球与六水合硝酸钴的质量比为1：1.5~1：2.5；二氧化锰微球与2
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甲基咪唑的质量比为1：3~1：5。4.一种基于权利要求1所述方法制备的二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球作为载体在制备固定化乙酰胆碱酯酶中的应用，其特征在于：将二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球分散在磷酸盐缓冲液中，在剧烈摇动条件下向悬浮液中加入乙酰胆碱酯酶溶液，室温振摇1~5 h后，离心收集混合物，并用磷酸盐缓冲液洗涤，即得固定化乙酰胆碱酯酶。5.如权利要求4所述的二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球作为载体在制备固定化乙酰胆碱酯酶中的应用，其特征在于：磷酸盐缓冲液的pH值为7~11；乙酰胆碱酯酶溶液的浓度为0.1~0.8 mg/mL。6.如权利要求4所述的二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球作为载体在制备固定化乙酰胆碱酯酶中的应用，其特征在于：二甲基咪唑钴修饰的二氧化锰微球与乙酰胆碱酯酶的质量比为200：1 ~25：1。7.一种基于权利要求4所述的固定化乙酰胆碱酯酶在筛选中药旋覆花中乙酰胆碱酯酶抑制剂的应用。8.如权利要求7所述固定化乙酰胆碱酯酶在筛选中药旋覆花中乙酰胆碱酯酶抑制剂的应用，其特征在于：包括以下步骤：将风干的旋覆花根茎用乙醇萃取，减压蒸馏滤液以获得旋覆花提取液，将其用体积比为1:1乙酸乙酯和H2O提取，对旋覆花提取液和乙酸乙酯组分利用固定化乙酰胆碱酯酶孵育后进行酶抑制活性评估，对乙酰胆碱酯酶具有抑制作用；乙酸乙酯层用CHCl2‑
MeOH洗脱，得到四个组分A
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D，对组分A
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D利用固定化乙酰胆碱酯酶孵育后进行酶抑制活性评估，B组分和C组分具有较强的抑制活性；组分C通过MPLC在RP
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18上用MeOH
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H2O洗脱进行分离，得到6个亚组分C1
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C6；馏分C3通过HPLC纯化得到化合物1；通过MPLC在RP
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18硅胶柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘佳，师彦平，哈伟，马蕊，
申请(专利权)人：中国科学院兰州化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：