肽-黑色素结合的优化制造技术

本发明专利技术涉及与肽复合的黑色素用作免疫刺激组合物的用途，所述肽特别地含有表位，其中所述肽已进行了修饰以增加亲核性。所述肽已进行了修饰以增加亲核性。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肽
‑
黑色素结合的优化


[0001]本专利技术属于肽递送领域，特别是用于免疫学目的，尤其是属于佐剂(即增强抗原的免疫原性特性的元素)领域，并且特别可用于疫苗(无论是预防性的还是治疗性的)领域。

技术介绍

[0002]黑色素是一种色素，通过前体的氧化聚合获得。
[0003]黑色素广泛存在于动物界，尤其是但不仅限于皮肤中，认为黑色素具有数种功能(d'Ishia等人，2015)，其中：
[0004]‑
对致突变光的光保护，这是其最重要的生物学功能之一。
[0005]‑
对氧化应激的保护(自由基清除剂)
[0006]‑
毛发和皮肤色素沉着
[0007]‑
昆虫的先天免疫
[0008]‑
金属稳态
[0009]在黑色素上移植生物活性分子(如肽、蛋白质、糖蛋白或脂质)可用于利用黑色素的生物学特性和物理化学特性。
[0010]‑
黑色素可以保护结合的分子免受紫外线、化合物或酶的降解。
[0011]‑
黑色素吸收光，因此可以选择性加热结合的分子。
[0012]‑
当注射到体内(例如皮下注射)时，黑色素产生一种可以允许局部释放的贮库效应。黑色素一旦被注射，也被部分驱赶到引流淋巴结，因此可以用作分子到达淋巴系统的载体。如Carpentier等人(PLoS One.2017年7月17日；12(7):e0181403)和WO2017089529所公开的，这些特性特别可用于疫苗方法。
[0013]历史上的疫苗是基于减毒活病原体、完整灭活生物体、或修饰的毒素。为了限制潜在的副作用，最近的发展专注于亚单位疫苗，其通常由30
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60个氨基酸组成，但可以限制为一个短至8个氨基酸的表位。使用抗原的一小部分通过将免疫应答集中在抗原的期望部分来限制潜在的交叉反应风险。然而，由于缺乏病原体衍生的分子作为危险信号，亚单位疫苗(尤其是肽亚单位疫苗)通常免疫原性差。因此，亚单位疫苗需要额外的佐剂才能有效(Fujita等人,Chem Cent J.2011；5(1):48；Azmi等人,Hum Vaccin Immunother.2014；10(3):778
‑
96)。
[0014]尽管取得了所有这些进展，但现代疫苗仍面临一些限制。亚单位抗原通常免疫原性差。触发免疫所需的抗原剂量(通常在10至300μg的范围内)可能是一个限制因素，尤其是当抗原难以制造或需求超过生产能力时。此外，诱导CD8+应答仍然是一项困难的挑战，因为细胞外分子通常由MHC II类而不是MHC I类呈递。最后，疫苗制剂(如乳液、脂质体、融合分子)可能不稳定或难以合成，使得制造成本有时高得令人望而却步。因此，理想的佐剂应当有效触发或增强Ag特异性免疫应答(体液应答和细胞应答)、易于制造、无毒且稳定。
[0015]黑色素色素是本领域已知和识别的，并且不同于作为黑色素前体的单纯氨基酸多肽。例如，通过蛋白质合成(将一个氨基酸的N
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末端与另一个氨基酸的C
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末端连接)获得的
聚酪氨酰或聚多巴肽，未经氧化聚合，不是黑色素分子也不会被本领域技术人员视为黑色素分子。
[0016]因此，黑色素是一个广泛而通用的术语，用于指在大多数生物体中发现的一组天然色素，其由氨基酸酪氨酸(或另一种前体)氧化然后聚合而产生。该氧化是关键步骤，通常由酪氨酸酶介导，所述酪氨酸酶将酪氨酸转化为多巴。
[0017]因此，黑色素是通过复杂的过程(如图1中所提醒)获得的，所述过程组合了黑色素前体的氧化及其随后的聚合。
[0018]黑色素天然存在于许多生物体中，也可以合成产生(体外氧化聚合)，例如由Sigma Aldrich出售的用过氧化氢氧化酪氨酸来制备的合成黑色素。
[0019]黑色素合成涉及数种中间化合物、数种酶，并且可以通过pH、阳离子金属的存在、温度进行调整。
[0020]作为中间化合物，可以举出：L
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苯丙氨酸、L
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酪氨酸、L
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多巴、多巴醌、环多巴、多巴色素、醌甲基化物(quinone methide)、苯并噻唑、苯并噻嗪、二氢七叶亭(dihydroesculetin)、二羟基吲哚羧酸(DHICA)、5,6
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二羟基吲哚(DHI)、多巴胺邻醌、多巴胺白多巴胺色素(Dopamine Leukodopaminochrome)、多巴胺色素(dopaminochrome)、去甲肾上腺素、去甲腺色素(noradenochrome)、肾上腺素、腺色素(adenochrome)、3
‑
氨基酪氨酸等。
[0021]作为参与合成的酶，可以举出：苯丙氨酸羟化酶、酪氨酸酶(EC 1.14.18.1和EC1.10.3.1)、蘑菇酪氨酸酶、酪氨酸羟化酶、过氧化物酶、酚氧化酶、多巴色素互变异构酶(E.C.5.3.2.3、DCT/Trp2)；DHICA氧化酶(Trp1)DHI氧化酶。
[0022]合成黑色素是黑色素前体体外氧化聚合的产物。这种聚合在氧化剂的存在下进行。如上所述，这种黑色素可以与天然黑色素区分，因为它会更同质一些。
[0023]Arnon等人(1960
‑
Biochem.J.,75:103
‑
109)公开了抗原蛋白(即明胶、卵白蛋白或麻仁球蛋白)与不是黑色素的聚酪氨酰结合。
[0024]Sela等人(Biochem.J.,vol.75,1960年1月1日(1960
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01
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01),91
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102页)公开了获得多肽基明胶的操作过程。没有氧化聚合，获得的产物不包含黑色素也不能认为是黑色素。
[0025]Akagi等人(在："Bioactive Surfaces”中,2011年1月1日(2011
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01
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01),Springer Berlin Heidelberg,Berlin,Heidelberg,Adv Polym Sci,vol.247,31
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64页)公开了可生物降解的纳米颗粒作为疫苗佐剂和递送系统。用酪氨酸制备了聚氨基酸纳米粒子，但该文件没有公开或提及黑色素或聚合将产生黑色素作为最终产物。
[0026]US 2004/057958公开了一种免疫原性载体，其可以是聚氨基酸聚合物。该文件从未提及或建议使用黑色素作为免疫原。
[0027]Fujita等人(Chemistry Central Journal,Biomed Central Ltd,vol.5,no.1,2011年8月23日(2011
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08
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23),48页)回顾了使用纳米颗粒的多种抗原呈递肽疫苗系统的情况。该文件没有提及或建议制备黑色素和抗原的复合物以增加抗原的免疫原性。
[00本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于获得组合物的方法，所述方法包括a)提供通过黑色素前体的氧化聚合获得的合成黑色素，和b)将其与已通过加入一个或数个含有亲核残基的氨基酸进行了修饰的肽混合，以获得包含与修饰肽结合的黑色素的组合物。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述黑色素是可溶黑色素。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述肽是免疫活性肽。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中加入所述肽的氨基酸选自：半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸、组氨酸和赖氨酸。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中已将氨基酸肽加到所述肽的N
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末端。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中加入所述肽的氨基酸是半胱氨酸，并且被加到所述肽的N
‑
末端。7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中通过加入一个或数个含有亲核残基的氨基酸进行了修饰的肽选自：SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、和SEQ ID NO:33。8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述黑色素前体选自：L
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多巴、DHICA、DHI、L
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酪氨酸、D
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多巴、6
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羟基多巴、多巴醌、环多巴、多巴色素、多巴胺邻醌、多巴胺、白多巴胺色素和多巴胺色素。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述黑色素前体是L
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多巴。10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其中所述氧化聚合...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：阿特瓦斯公司巴黎西岱大学，
类型：发明
国别省市：