一种对氨基苯甲酸羟化酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种对氨基苯甲酸羟化酶及其应用，属于生物工程领域。解决了氨基苯甲酸羟化酶催化效率低的技术问题。本发明专利技术提供了一种来自于Agaricus bisporus var.bisporusH97的一种对氨基苯甲酸羟化酶并且编码的基因经过优化后得到新的基因，新基因应用为编码具有催化对氨基苯甲酸脱羧羟化生成对氨基苯酚的对氨基苯甲酸羟化酶。可以用于氨基酚类化合物的绿色生物制备，具有重要的工业应用潜力。具有重要的工业应用潜力。具有重要的工业应用潜力。

【技术实现步骤摘要】
一种对氨基苯甲酸羟化酶及其应用


[0001]本专利技术属于生物工程领域，具体涉及一种对氨基苯甲酸羟化酶及其应用。

技术介绍

[0002]氨基苯酚类化合物似是我国应用较广泛的一种精细有机化工中间体，应用于染料工业、医药工业、也用于制备显影剂、抗氧剂和石油添加剂等产品。目前氨基酚的合成都是采用化学法，其合成路线基本都是以硝基苯酚纳、苯酚、硝基苯为原料进行，虽然此类化学合成的技术较为成熟，但其中仍存在很多的问题例如：原料毒性较大；反应条件苛刻且催化剂成本高，生产过程会产生大量的含酚含胺污水等。因此我们希望开发氨基酚的绿色生物合成方法，这就需要寻找能高效催化反应的酶。对氨基苯甲酸羟化酶(4
‑
aminobenzoate hydroxylase)是一种来源于双孢蘑菇变种株Agaricus bisporus var.bisporus H97的以FAD，NADH为辅酶的脱羧羟化酶，可用于催化对氨基苯甲酸及类似物脱羧羟化生产对氨基酚等的反应，目前为止只有一例此类酶及活性的研究报导(Purification and properties of 4
‑
aminobenzoate hydroxylase,a new monooxygenase from Agaricus bisporus.Journal of Biological Chemistry,1986,261(28):13203
‑
13209.)。然而目前对于该对氨基苯甲酸羟化酶的获取方法依旧依赖于由蘑菇中分离，整个过程繁琐，蛋白不稳定来源有限，且该酶催化效率较低，因此需要寻找活性更高的对氨基苯甲酸羟化酶。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是为了提供一种具有稳定来源的氨基苯甲酸羟化酶，解决了氨基苯甲酸羟化酶催化效率低的技术问题。
[0004]在一种实施方式中，所述氨基苯酚类化合物为对氨基苯甲酸、2
‑
氨基
‑3‑
羟基苯甲酸、2
‑
氨基
‑4‑
氯苯甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
氯苯甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
氟苯甲酸、4
‑
氨基
‑2‑
氟苯甲酸、5
‑
氟邻氨基苯甲酸和4
‑
氟邻氨基苯甲酸中的任意一种。
[0005]本专利技术提供了一种对氨基苯甲酸羟化酶，所述对氨基苯甲酸羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0006]本专利技术还提供了一种编码上述对氨基苯甲酸羟化酶的基因。
[0007]本专利技术提供了一种酶制剂，所述酶制剂含有上述的对氨基苯甲酸羟化酶。
[0008]本专利技术提供了一种重组微生物细胞，所述重组微生物含上述对氨基苯甲酸羟化酶或山上述的基因。
[0009]在一种实施方式中，所述微生物细胞为原核生物或真核生物。
[0010]在一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌。
[0011]本专利技术提供了一种促进氨基苯酚类化合物催化反应的方法，所述方法是将上述重组微生物细胞加入到含有苯胺类化合物的水溶液中，在pH＝4
‑
10，温度为30
‑
60℃的条件下进行催化反应。
[0012]在一种实施方式中，所述氨基苯酚化合物为对氨基苯甲酸、2
‑
氨基
‑3‑
羟基苯甲
酸、2
‑
氨基
‑4‑
氯苯甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
氯苯甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
氟苯甲酸、4
‑
氨基
‑2‑
氟苯甲酸、5
‑
氟邻氨基苯甲酸和4
‑
氟邻氨基苯甲酸中的任意一种。
[0013]本专利技术还提供了上述的对氨基苯甲酸羟化酶、上述的酶制剂、上述的重组微生物细胞在催化氨基苯酚类化合物脱羧羟化反应中的应用。
[0014]在一种实施方式中，所述氨基苯酚化合物为对氨基苯甲酸、2
‑
氨基
‑3‑
羟基苯甲酸、2
‑
氨基
‑4‑
氯苯甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
氯苯甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
氟苯甲酸、4
‑
氨基
‑2‑
氟苯甲酸、5
‑
氟邻氨基苯甲酸和4
‑
氟邻氨基苯甲酸中的任意一种。
[0015]有益效果：由Agaricus bisporus var.bisporus H97中发现一种新型的对氨基苯甲酸羟化酶，并首次由大肠杆菌中表达纯化获得，本专利技术中的对氨基苯甲酸羟化酶可以催化对氨基苯甲酸脱羧羟化生成对氨基苯酚，其催化活性是已有报导类似酶的3倍。该酶还可以高效催化一系列未报导的氨基苯甲酸底物生成相应的氨基酚如：2
‑
羟基
‑
4氨基苯酚、2
‑
氨基
‑3‑
羟基苯酚、2
‑
氨基
‑4‑
氯苯酚、4
‑
氨基
‑3‑
氯苯酚、4
‑
氨基
‑3‑
氟苯酚、4
‑
氨基
‑2‑
氟苯酚、5
‑
氟邻氨基苯酚、4
‑
氟邻氨基苯酚，可用于相应氨基酚的绿色生物制备，具有重要的工业应用潜力。
附图说明
[0016]图1为对氨基苯甲酸羟化酶SDS
‑
PAGE图；
[0017]图2为对氨基苯甲酸羟化酶催化对氨基苯甲酸反应，其中，i:BL21(DE3)
‑
pETDuet
‑
ABH60对氨基苯甲酸反应HPLC检测图；ii：BL21(DE3)
‑
pETDuet
‑
ABH与对氨基苯甲酸反应HPLC检测图；iii：对氨基苯酚标准品HPLC检测图；
[0018]图3为对氨基苯甲酸羟化酶催化反应示意图；
[0019]图4为对氨基苯甲酸羟化酶ABH60与文献报导的氨基苯甲酸羟化酶ABH氨基酸序列比对。
具体实施例
[0020]下面结合具体实施例对本专利技术做进一步说明，但本专利技术不受实施例的限制。
[0021]以下实施例中所用材料、试剂、仪器和方法，未经特殊说明，均为本领域中的常规材料、试剂、仪器和方法，均可通过商业渠道获得。所用酶试剂购自NEW ENGLAND BioLabs公司，提取质粒所用的试剂盒和回收DNA片段所用的试剂盒购自美国OMEGA公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。
[0022]培养基配方：LB培养基：5g/L酵母粉，10g/L NaCl，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种对氨基苯甲酸羟化酶，其特征在于，所述对氨基苯甲酸羟化酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述氨基苯酚类化合物为对氨基苯甲酸、2
‑
氨基
‑3‑
羟基苯甲酸、2
‑
氨基
‑4‑
氯苯甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
氯苯甲酸、4
‑
氨基
‑3‑
氟苯甲酸、4
‑
氨基
‑2‑
氟苯甲酸、5
‑
氟邻氨基苯甲酸和4
‑
氟邻氨基苯甲酸中的任意一种。3.编码权利要求1所述的对氨基苯甲酸羟化酶的基因。4.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂含有权利要求1所述的对氨基苯甲酸羟化酶。5.一种重组微生物细胞，其特征在于，所述重组微生物细胞含有权利要求1所述对氨基苯甲酸羟化酶或权利要求3所述的基因。6.根据权利要求5所述重组微生物细胞，其特征在于，所述微生物细胞为原核生物或真核生物。7.根据权利要求6所述的重组微生物细胞，其特征在于，所述微生...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄伟，咸漠，侯斐斐，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：