利用塔拉粉酶法同步制备没食子酸和奎尼酸的方法技术

本发明专利技术提供了一种利用塔拉粉酶法同步制备没食子酸和奎尼酸的方法，将黑曲霉种子液发酵，加入诱导底物塔拉粉或塔拉单宁酸进行培养，制备塔拉单宁酶粗酶液，粗酶液催化塔拉粉进行酶解反应，反应后的液体进行超滤，透过液进行2级纳滤处理，二级纳滤的浓缩液加入离子液体进行萃取，得到上层液体和下层液体，上层液体含有没食子酸，下层液体含有奎尼酸；上层液体和下层液体分别用碱中和回收离子液体进行回用；去除离子液体后的上层液体和下层液体分别经冷却结晶，酸化后加入醇类物质进行重结晶，得到没食子酸和奎尼酸。本发明专利技术无需活性炭脱色和离子交换吸附等操作，奎尼酸总回收率达到81%以上，没食子酸总回收率达到85%以上。没食子酸总回收率达到85%以上。没食子酸总回收率达到85%以上。

【技术实现步骤摘要】
利用塔拉粉酶法同步制备没食子酸和奎尼酸的方法


[0001]本专利技术属于精细化工与酶工程领域，具体涉及一种利用塔拉粉酶法同步制备没食子酸和奎尼酸的方法。

技术介绍

[0002]塔拉是属于苏木科云实属，主要分布于南美洲西北部秘鲁、厄瓜多尔、哥伦比亚等国家。我国也有一定规模种植，该植物因其果荚富含塔拉单宁，具有与中国的五倍子单宁相似的性能，常常作为没食子酸制备的另一种原料，但其中大约15～20％的奎尼酸，大多没有加以资源化回收。
[0003]关于没食子酸的提取方法，一般有化学法和酶法。化学法采用碱法，文献(陈笳鸿，张宗和，汪咏梅，毕良武，吴在篙，吴冬梅.塔拉粉直接碱水解制备没食子酸的工艺研究及应用[J].林产化学与工业，1995(01)：1
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8.)进行了报道。每生产1吨要需要9吨左右的碱，废水排放量大，总收率为70％左右。奎尼酸分子遭到破坏，无法回收利用。关于酶法制备工艺，1994年贵州省化工研究院最早报道。专利CN1083532A报道的权利保护在发酵产酶和简单水解工艺，没有报道相关收率和分离纯化方法。集美大学杨秋明团队报道了塔拉单宁酶解生产没食子酸的工艺优化(陈培旭，刘春利，王思渊，杨秋明，张永辉，肖安风.塔拉单宁酶解生产没食子酸的工艺优化[J].现代食品科技，2020,36(12)：60
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68.)。该方法利用毕赤酵母表达基因工程塔拉单宁酶，然后进行酶解工艺研究，确定最佳酶解方案为塔拉粉料液比1∶40，反应温度65℃，pH＝4，在此条件下没食子酸得率达到65.98％，酶解温度高，收率低，不易产业化，对于高附加值奎尼酸没有加以回收利用。
[0004]周道兵等专利技术了一种用真空蒸发法分离去除盐酸，用乙醚萃取法分离去除没食子酸，用活性炭吸附法和强碱阴离子交换法分离去除色素和糖类物质来回收奎尼酸的方法，具体操作如下：以2000ml塔拉单宁经酸水解制备没食子酸后的废液为原料，在化学纯浓度的冰醋酸作用下，液相比：甲醇：水＝1∶1时，收率或转化率可以达到77.95％(周道兵，陈笳鸿，汪咏梅等塔拉单宁水解废液回收奎尼酸的工艺试验【J】.林产化工通讯，2001，35(1)：17)。该方法要用到大量有机溶剂，生产安全性低，难于实现产业化。
[0005]刘凡等专利技术了一种塔拉制备没食子酸废液中奎尼酸回收方法，该专利技术从没食子酸回收废液中，先用陶瓷膜过滤法除去大分子有机杂质，然后用沉降法除去废液中机械杂质，用纳滤膜过滤法降低盐浓度，用离子树脂交换法吸附，经过水或盐酸水溶液洗脱回收奎尼酸，粗品用活性炭脱色，采用甲醇或乙醇水溶液进行重结晶，得到奎尼酸纯品，纯度为95％以上，收率在80％以上(张家界久瑞生物科技有限公司，一种塔拉制备没食子酸废液中奎尼酸回收方法[P].中国CN107673511A，2018.02.09)。该方法采用分步回收没食子酸和奎尼酸，活性炭脱色对两种酸的回收损失量大，产品纯度不高，重结晶采用了大量甲醇和乙醇水溶液等有机溶剂，操作安全性降低。
[0006]由于上述方法均为分别分离没食子酸和奎尼酸，没有同时获得没食子酸和高附加值奎尼酸，在价格上很难与五倍子单宁提取没食子酸相竞争，很难实现产业化。

技术实现思路

[0007]本专利技术提供一种利用塔拉粉酶法同步制备没食子酸和奎尼酸的方法，可以同步获得高纯度的没食子酸和奎尼酸。
[0008]本专利技术的技术方案是，一种利用塔拉粉酶法同步制备没食子酸和奎尼酸的方法，包括以下步骤：
[0009]S1、将黑曲霉孢子进行活化制备黑曲霉孢子悬浮液，将悬浮液接种到种子培养基中培养得到种子液，然后加入诱导底物塔拉粉或塔拉单宁酸进行培养，经板框过滤得到塔拉单宁酶粗酶液；
[0010]S2、粗酶液置于生物催化反应器中，加入塔拉粉，进行酶解反应，反应温度30～50℃，酶解时间30～50h，反应后的液体进行超滤，得到的浓缩液用于回收催化用酶，透过液备用；
[0011]S3、透过液进行二级纳滤处理，一级纳滤的透过液进行二级纳滤，二级纳滤的浓缩液加入离子液体进行萃取，得到上层液体和下层液体，上层液体和下层液体分别用碱中和，得到的上层液体为离子液体，进行回用；2种下层液体经冷却结晶，酸化后加入醇类物质进行重结晶，得到没食子酸和奎尼酸。
[0012]进一步地，黑曲霉孢子悬浮液中，孢子数量为1
×
105～5
×
105个/mL；种子培养基中，KH2PO4为0.3
‑
0.9g/L，酵母浸粉3
‑
7g/L，NH4NO30.5
‑
1.5g/L，蛋白胨1
‑
5g/L，葡萄糖10
‑
30g/L；悬浮液接种量为总培养基的0.5～2wt％，pH 4
‑
6，温度25
‑
30℃，转速100
‑
300r/min，培养2
‑
3天。
[0013]进一步地，S1中诱导底物用量为总培养基的0.5～1.5wt％，培养2～6天，测定塔拉单宁酶的酶活达到12～20U/mL时发酵终止，板框过滤得到未反应完的塔拉粉，清液为粗酶液。
[0014]进一步地，S2酶解反应中，加酶量为3～10U/g塔拉干粉塔拉粉，酶解时搅拌转速为100～300r/min。塔拉粉与粗酶液的质量比为1∶30～1∶80，优选1∶50；加酶量优选为5U/g塔拉干粉，酶解温度优选37℃，搅拌转速优选为150r/min，酶解时间优选48h，酶解转化率(以没食子酸计)可以达到88.5％。
[0015]进一步地，S2中超滤超滤膜为10
‑
30kD，透过液流速为200
‑
500L/h，浓缩液含有塔拉单宁酶，用于循环利用至少5次以上。
[0016]进一步地，S3中一级纳滤时，采用500
‑
800D的纳滤膜，透过液流量控制100～300L/h，浓缩液流量控制在80
‑
120L/h；二级纳滤采用100～200D的纳滤膜，透过液流量为100
‑
300L/h，浓缩液流量控制在50
‑
100L/h。进一步地，S3中一级纳滤时，采用500
‑
800D的纳滤膜，透过液流量控制100～300L/h，浓缩液流量控制在80
‑
120L/h；一级纳滤将大分子量的物质截留，浓缩液中大多是含有的没食子酸的寡聚物，可以进入酶解反应器，进一步回收利用；二级纳滤采用100～200D的纳滤膜，去除盐类和小分子物质，透过液流量为100
‑
300L/h，浓缩液流量控制在50
‑
100L/h，浓缩液中富含没食子酸和奎尼酸。
[0017]进一步地，S3中离子液体为咪唑类离子液体，离子液体与二级纳滤的浓缩液体积比为1∶1～1∶3。
[0018]进一步地，S3中离子液体混合物，采用苄基
‑3‑
甲基咪唑氯盐或1
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苄本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用塔拉粉酶法同步制备没食子酸和奎尼酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、将黑曲霉孢子进行活化制备黑曲霉孢子悬浮液，将悬浮液接种到种子培养基中培养得到种子液，然后加入诱导底物塔拉粉或塔拉单宁酸进行培养，经板框过滤得到塔拉单宁酶粗酶液；S2、粗酶液置于生物催化反应器中，加入塔拉粉，进行酶解反应，反应温度30～50℃，酶解时间30～50h，反应后的液体进行超滤，得到的浓缩液用于回收催化用酶，透过液备用；S3、透过液进行二级纳滤处理，一级纳滤的透过液进行二级纳滤，二级纳滤的浓缩液加入离子液体进行萃取，得到上层液体和下层液体，上层液体和下层液体分别用碱中和，得到的上层液体为离子液体，进行回用；2种下层液体经冷却结晶，酸化后加入醇类物质进行重结晶，得到没食子酸和奎尼酸。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：黑曲霉孢子悬浮液中，孢子数量为1
×
105~5
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105个/mL；种子培养基中，KH2PO4为0.3
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0.9g/L，酵母浸粉3
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7g/L，NH4NO30.5
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1.5g/L，蛋白胨1
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5g/L，葡萄糖10
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30 g/L；悬浮液接种量为总培养基的0.5～2wt%，pH 4
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6，温度25
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30℃，转速100
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300 r/min，培养2
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3天。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S1中诱导底物用量为总培养基的0.5～1.5wt%，培养2~6天，测定塔拉单宁酶的酶活达到12～20U/mL时发酵终止，板框过滤得到未反应完的塔拉粉，清液为粗酶液。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：S2酶解反应中，加酶量为3～10U/g塔拉干粉塔拉粉，酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈赤清，毛业富，刘义稳，龚大春，张子恒，李忠辉，
申请(专利权)人：五峰赤诚生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：