一种诱导RNA干扰和降低并清除细胞中病毒污染的核苷酸序列及应用制造技术

本发明专利技术公开了一种可用于降低并清除Sf细胞中Sf

【技术实现步骤摘要】
一种诱导RNA干扰和降低并清除细胞中病毒污染的核苷酸序列及应用


[0001]本专利技术涉及一种用于诱导RNA干扰和降低并清除细胞中病毒污染的核苷酸序列及组合、应用此组核苷酸序列及组合获得无病毒细胞系的方法，以及应用此方法获得的不含污染病毒的连续细胞系，所述无病毒细胞系源自被病毒污染的生物体或细胞群体。

技术介绍

[0002]以Sf9细胞为基础的杆状病毒表达系统已被广泛应用于疫苗、蛋白及基因的表达与生产。而在2014年发现该细胞系中存在一种新型的弹状病毒，因此该细胞系作为临床治疗药物的产生源头，存在潜在的安全风险。
[0003]草地贪夜蛾弹状病毒(Sf
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rhabdovirus)是一种新型弹状病毒，存在于Sf(Spodoptera frugiperda)细胞内(例如，Sf9，Sf21)。该病毒是由美国食品药物监督局的研究人员通过简并PCR和大规模平行测序(MPS)而发现的。Sf
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弹状病毒全基因组长13584bp，主要包含5个基因，分别编码保守蛋白N(nucleocapsid)，P(phoprotein)，M(matrix)，G(glycoprotein)和L(ploymerase)，另有一种未知基因编码非保守蛋白X，其功能未知。Sf
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弹状病毒属于单链(
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)RNA病毒，病毒的复制机制是由病毒粒子内的RNA依赖的RNA聚合酶将RNA转录成mRNA，从而表达相应蛋白，主要在细胞质内增殖，以出芽方式释放。不能单独进行繁殖，只能在活细胞内增殖。
[0004]对Sf
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弹状病毒的控制策略主要有两种方法：一种是在样品生产纯化过程中进行去除；二是直接从Sf9细胞中去除Sf
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弹状病毒。从生产纯化过程中去除Sf
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弹状病毒，会随着药物生产次数的增多而增加生产成本，且在生产源头细胞中一直存在Sf
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弹状病毒，仍然存在污染隐患，会给生产带来不可避免的影响。而从Sf9细胞中直接去除Sf
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弹状病毒则从源头上避免了病毒的污染，能够有效对Sf
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弹状病毒进行控制。
[0005]新的不含外源病毒的昆虫细胞系已被分离出来，并作为改进的研究工具和更安全的生物制造平台使用。为了完全去除Sf9细胞中的Sf
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弹状病毒，格里科贝克公司采用核苷类药物(例如，6
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氮杂尿苷)处理由若干个细胞组成的起始培养物，通过进一步扩增培养，获得了无Sf
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弹状病毒的细胞系(专利申请号CN201680071306.3)。该专利申请在实际筛选中尝试了施用多种药物共同抑制的方法，施用多种抗病毒药物会影响细胞代谢及生物合成过程，加重细胞损伤，影响筛选后细胞重组及生产病毒的能力。虽另有其它的研究表明，在不加入抗病毒药物的情况下，通过筛选获得了生长特性相似，活力更优的细胞系(专利申请号CN201910317758.0)，但由该种方法获得无病毒细胞系的效率是很低的。
[0006]综上所述，目前抑制Sf9细胞内Sf
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弹状病毒的方法主要是采用核苷类化学药物，但其抑制方式属于广谱抗病毒，在抑制病毒的同时可能会阻碍细胞自身基因的合成和转录，对细胞造成一定的伤害。
[0007]因此，对于能够有效和稳定地从病毒污染的生物体或细胞群体中获得并建立无病毒细胞系的方法，以及不含污染病毒的细胞系，且该细胞系能够保持其原有的细胞生物学
NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8组合的序列；或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8组合的序列。
[0016]在某些实施方式中，所述dsRNA是对上述序列的核苷酸进行修饰后所得的修饰性dsRNA。
[0017]本专利技术还提供了一种dsRNA组合，所述dsRNA组合由上述dsRNA中的任意两个或多个组成。
[0018]在本专利技术的一个具体实施方式中，所述dsRNA组合为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的dsRNA的组合；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的dsRNA的组合；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的dsRNA的组合；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8所示的dsRNA的组合；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示的dsRNA的组合；或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的dsRNA的组合。
[0019]本专利技术还提供了由切割上述dsRNA或dsRNA组合而获得siRNA分子。
[0020]在本专利技术的另一个具体实施方式中，所述siRNA可由SEQ ID NO：1
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8所示任一条序列或其组合内部的任意14
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30个连续的核苷酸组成，优选16
‑
25个连续的核苷酸，更优选18
‑
21个连续的核苷酸。
[0021]本专利技术还提供了一种编码上述dsRNA的DNA序列。在本专利技术的一个具体实施方式中，本专利技术的一种编码上述dsRNA的DNA序列为SEQ ID NO：9
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16中任一所示的序列或其组合。
[0022]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述一种编码上述dsRNA的DNA序列为：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11组合的序列；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组合的序列；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12组合的序列；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16组合的序列；SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16组合的序列；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16组合的序列。
[0023]在某些实施方式中，所述DNA是对上述序列的核苷酸进行修饰后所得的修饰性DNA。
[0024]本专利技术还提供了一种编码dsRNA组合的DNA组合，所述DNA组合由上述SEQ ID NO：9
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16中的任意两个或多个组成。
[0025]在本专利技术的某些具体实施方式中，所述一种编码dsRNA组合的DNA组合为：SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的DNA的组合；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的DNA的组合；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的DNA的组合；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16所示的DNA的组合；SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于诱导RNA干扰的dsRNA，其特征在于，所述dsRNA的序列为SEQ ID NO：1
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8中任一个所示的序列或其组合。2.根据权利要求1所述的dsRNA，其中所述序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3组合的序列；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3组合的序列；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4组合的序列；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：8组合的序列；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8的组合的序列；或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8的组合的序列。3.对权利要求1或2所述的dsRNA进行核苷酸修饰后所得的修饰性dsRNA。4.一种用于诱导RNA干扰的dsRNA组合，其特征在于，所述dsRNA组合由权利要求1所述dsRNA中的任意两个或多个组成。5.根据权利要求4所述的dsRNA组合，其中所述dsRNA组合为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3所示的dsRNA的组合；SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的dsRNA的组合；SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的dsRNA的组合；SEQ ID NO：3所示和SEQ ID NO：8所示的dsRNA的组合；SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：8所示的dsRNA的组合；或SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8所示的dsRNA的组合。6.由权利要求1
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5中任一项所述的dsRNA或dsRNA组合切割获得的siRNA。7.根据权利要求6所述的siRNA，其序列由SEQ ID NO：1
‑
8中任一项所示序列或其组合内部的任意14
‑
30个连续的核苷酸组成，优选16
‑
25个连续的核苷酸，更优选18
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21个连续的核苷酸。8.编码权利要求1所述dsRNA的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列为SEQ ID NO：9
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16中任一项所示的序列或其组合。9.根据权利要求8所述的DNA序列，其中所述DNA序列为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11组合的序列；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11组合的序列；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12组合的序列；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16组合的序列；SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16组合的序列；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16组合的序列。10.对权利要求8或9所述的DNA进行核苷酸修饰后所得的修饰性DNA。11.编码权利要求4所述的dsRNA组合的DNA组合，其特征在于，所述DNA组合由SEQ ID NO：9
‑
16中的任意两个或多个组成。12.根据权利要求11所述的DNA组合，其中所述DNA组合为SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：11所示的DNA的组合；SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示的DNA的组合；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：12所示的DNA的组合；SEQ ID NO：11和SEQ ID NO：16所示的DNA的组合；SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：16所示的DNA的组合；或SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO...

【专利技术属性】
技术研发人员：范英俊，
申请(专利权)人：北京三诺佳邑生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：