一种抑制番茄果实成熟的基因SlWRKY71及其调控方法技术

一种抑制番茄果实成熟的基因SlWRKY71及其调控方法，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。本发明专利技术通过从番茄中得到SlWRKY71基因完整的编码序列，设计靶点，将靶点连接到载体CRIPSR

【技术实现步骤摘要】
一种抑制番茄果实成熟的基因SlWRKY71及其调控方法


[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种抑制番茄果实成熟的基因SlWRKY71及其调控方法，特别涉及一种WRKY家族的转录因子SlWRKY71，该基因在负调控番茄果实成熟中的应用。

技术介绍

[0002]番茄（学名：Solanum lycopersicum），即西红柿，是管状花目、茄科、番茄属的一种一年生或多年生草本植物。番茄原产南美洲，中国南北方广泛栽培。番茄的果实营养丰富，具特殊风味。番茄果实成熟是植物特有的生理特性，对种子的传播和植物的繁殖具有重要作用。番茄（Solanum lycopersicum）作为一种经典的呼吸跃变型果实模型，在果实成熟和衰老方面得到了广泛的研究。寻找新的参与调控果实成熟的功能基因，依然是园艺领域的重要目标，有助于提高农作物的商业价值。
[0003]WRKY是植物中一个独特的转录因子家族，具有一个或两个保守的氨基酸序列 WRKYGQK 和一个锌指结构基序。并始终与下游基因启动子的(T)(T)TGCA(C/T)元件(W
‑
box)结合，从而参与植物信号传递、乙烯生物合成、非生物胁迫响应和成熟衰老过程。例如，SlWRKY31和SlWRKY23在番茄果实的破色期和红熟期均有高表达，这代表WRKY转录因子（TFs）可以调控番茄果实的成熟和衰老。SlWRKY35通过直接激活番茄中的SlDXS1来增强类胡萝卜素的积。这些都表明WRKY转录因子在以自己独特的方式调控植物生长和果实成熟衰老。
[0004]虽然番茄的栽培面积不断扩增，但在许多地区番茄的消费过程还是受到运输、贮藏、出售等因素的限制。8
‑
9月为番茄成熟的高峰期，在此期间番茄供过于求，出售缓慢，导致很多番茄发霉、腐烂，影响番茄的质量，这不仅造成资源浪费，还给广大生产者带来经济上的损失，而选育早熟的番茄品种可以减少上述损失。早熟番茄的生长周期短，着色进程快，果实成熟提前，可以提早上市，这不仅可以提高番茄的商品性，还可以提高种植户的经济效益，调节淡季市场供应。
[0005]CRISPR/Cas系统由两部分构成：成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和CRISPR相关蛋白(Cas)。该系统发挥作用需要sgRNA(small guide RNA)和基因序列上的PAM结构(5
′‑
NGG)指引Cas蛋白发挥核酸内切酶作用。目前已知的Cas蛋白种类繁多，目前应用最广的Cas9属于Ⅱ型系统:Cas9与sgRNA结合形成复合体，构象发生改变，在sgRNA的引导下，该复合体能够识别基因序列上的PAM位点并锚定到靶位点。在Cas蛋白核酸内切酶的作用下，靶位点产生精确的双链断裂，启动细胞的自我修复机制。在通过非同源末端连接或同源重组途径进行修饰的过程中，对靶基因进行遗传修饰。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种抑制番茄果实成熟的基因SlWRKY71及其调控方法，为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种抑制番茄果实
成熟的基因SlWRKY71，所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。
[0007]为实现上述目的及其他相关目的，本专利技术提供的技术方案是：一种抑制番茄果实成熟的调控方法，包括下列步骤：步骤1：将靶点一正向引物
‑
F1、靶点一反向引物
‑
R1、靶点二正向引物
‑
F2和靶点二反向引物
‑
R2用无菌ddH2O混合稀释至浓度为1μM，然后置于PCR仪中，88
‑
92℃条件下处理25
‑
35 s，然后移至室温冷却，完成靶点引物退火，得到靶点接头引物混合物；靶点一正向引物
‑
F1：5
’‑
GTCACAATGGCAGCAGCCAAGAAA
‑3’
；靶点一反向引物
‑
R1：5
’‑
AAACTTTCTTGGCTGCTGCCATTG
‑3’
；靶点二正向引物
‑
F2：5
’‑
GTCAGGATGCACTACTCCCTCTCT
‑3’
；靶点二反向引物
‑
R2：5
’‑
AAACAGAGAGGGAGTAGTGCATCC
‑3’
；步骤2：配制包含步骤1中靶点接头引物混合物的酶切连接反应液，利用边切边连法，使靶点接头与gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒；步骤3：以步骤2得到的产物为模板，进行第一轮PCR扩增；步骤4：以步骤3得到的第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，扩增完成后估测产物浓度；步骤5：把步骤4得到的2个二轮PCR产物等量混合，用DNA产物纯化试剂盒纯化后取2 μL纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查产物纯化效果，浓度不低于5ng/μL即可进行下一步；步骤6：利用边切边连法进行gRNA表达盒与Cas9质粒的连接；步骤7：连接完成后取步骤6连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，测序检测；步骤8：将Crispr/Cas9
‑
SlWRKY71质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞；步骤9：将含有Crispr/Cas9
‑
SlWRKY71质粒的EHA105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗WRKY71。
[0008]步骤10：以番茄cDNA为模板，根据mRNA的序列分别设计两轮引物；第一轮引物无酶切位点，第二轮的上游引物需从起始密码子或起始密码子前面几个碱基开始，下游引物必须从终止密码子开始，二轮引物需引入酶切位点；以上游引物
‑
F和下游引物
‑
R进行PCR扩增，PCR扩增产物纯化后，得到目的基因片段；第一轮正向引物
‑
F1：5
’‑
ATGGGTGATGAACTAAGAGATTTG
‑3’
；第一轮反向引物
‑
R1：5
’‑ꢀ
TCATGGTTCTTGTTTAAGATTAAA
‑3’
；第二轮正向引物
‑
F2：5
’‑ꢀ
GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGTGATGAACTAAGAGATTTGTACT
‑3’
；第二轮反向引物
‑
R2：5
’‑ꢀ
CTTGTAATCGGTACCCTCGAGTGGTTCTTGTTTAAGATTAAACATAGAAGG
‑3’
；步骤11：用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶XhoI对载体pBI121进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pBI121载体；步骤12：目的基因片段和线性pBI121载体进行重组，得到WRKY71
‑
pBI121质粒；步骤13：将WRKY71
‑
pBI121质粒转化EHA1本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抑制番茄果实成熟的基因SlWRKY71，其特征在于：所述基因的核苷酸序列如Seq No.1所示。2.一种抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：包括下列步骤：步骤1：将靶点一正向引物
‑
F1、靶点一反向引物
‑
R1、靶点二正向引物
‑
F2和靶点二反向引物
‑
R2用无菌ddH2O混合稀释至浓度为1μM，然后置于PCR仪中，88
‑
92℃条件下处理25
‑
35 s，然后移至室温冷却，完成靶点引物退火，得到靶点接头引物混合物；靶点一正向引物
‑
F1：5
’‑
GTCACAATGGCAGCAGCCAAGAAA
‑3’
；靶点一反向引物
‑
R1：5
’‑
AAACTTTCTTGGCTGCTGCCATTG
‑3’
；靶点二正向引物
‑
F2：5
’‑
GTCAGGATGCACTACTCCCTCTCT
‑3’
；靶点二反向引物
‑
R2：5
’‑
AAACAGAGAGGGAGTAGTGCATCC
‑3’
；步骤2：配制包含步骤1中靶点接头引物混合物的酶切连接反应液，利用边切边连法，使靶点接头与gRNA表达盒连接，扩增gRNA表达盒；步骤3：以步骤2得到的产物为模板，进行第一轮PCR扩增；步骤4：以步骤3得到的第一轮PCR扩增产物为模板，进行第二轮PCR扩增，扩增完成后估测产物浓度；步骤5：把步骤4得到的2个二轮PCR产物等量混合，用DNA产物纯化试剂盒纯化后取2 μL纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，检查产物纯化效果，浓度不低于5ng/μL即可进行下一步；步骤6：利用边切边连法进行gRNA表达盒与Cas9质粒的连接；步骤7：连接完成后取步骤6连接产物通过化学热激法转化大肠杆菌DH5α，提取质粒，测序检测；步骤8：将Crispr/Cas9
‑
SlWRKY71质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞；步骤9：将含有Crispr/Cas9
‑
SlWRKY71质粒的EHA105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗WRKY71；步骤10：以番茄cDNA为模板，根据mRNA的序列分别设计两轮引物；第一轮引物无酶切位点，第二轮的上游引物需从起始密码子或起始密码子前面几个碱基开始，下游引物必须从终止密码子开始，二轮引物需引入酶切位点；以上游引物
‑
F和下游引物
‑
R进行PCR扩增，PCR扩增产物纯化后，得到目的基因片段；第一轮正向引物
‑
F1：5
’‑
ATGGGTGATGAACTAAGAGATTTG
‑3’
；第一轮反向引物
‑
R1：5
’‑ꢀ
TCATGGTTCTTGTTTAAGATTAAA
‑3’
；第二轮正向引物
‑
F2：5
’‑ꢀ
GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGTGATGAACTAAGAGATTTGTACT
‑3’
；第二轮反向引物
‑
R2：5
’‑ꢀ
CTTGTAATCGGTACCCTCGAGTGGTTCTTGTTTAAGATTAAACATAGAAGG
‑3’
；步骤11：用限制性内切酶BamHI和限制性内切酶XhoI对载体pBI121进行双酶切，酶切产物纯化后，得到线性pBI121载体；步骤12：目的基因片段和线性pBI121载体进行重组，得到WRKY71
‑
pBI121质粒；步骤13：将WRKY71
‑
pBI121质粒转化EHA105农杆菌感受态细胞；步骤14：含有WRKY71
‑
pBI121质粒的EHA105农杆菌侵染番茄子叶并获得转基因阳性苗SlWRKY71
‑
OE。
3.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤2中，所述酶切连接反应液为：1μL的10
×
cutsmart buffer，20ng的pYLgRNA
‑
AtU#质粒，0.5μL的接头引物混合物，0.4 μL的BsaI，0.1 μL的T4 DNA ligase，0.4 μL的T4 DNA ligase buffer，ddH2O补足至10 μL；PCR扩增参数为：37℃，5 min；20℃，5 min；5个循环。4.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤3包括2个PCR扩增反应，第一个第一轮PCR扩增为50 μL反应体系：1 μL的边切边连产物，4 μL的引物对U
‑
F/Rn，1μL的dNTPs，1 μL的Super
‑
Fidelity DNA Polymerase，10 μL的5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer，33μL的ddH2O；PCR条件：95℃，1 min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；25个循环；72℃，10 min；4℃，∞；第二个第一轮PCR扩增为50μL反应体系：1 μL的边切边连产物，4 μL的引物对Fn/gRNA
‑
R，1μL的dNTPs，1 μL的Super
‑
Fidelity DNA Polymerase，10μL的5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer，33μL的ddH2O；PCR条件：95℃，1 min；95℃，10s；60℃，15s；72℃，15s；25个循环；72℃，10 min；4℃，∞；U
‑
F：5
’‑
CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG
‑3’
；gRNA
‑
R：5
’‑
CGGAGGAAAATTCCATCCAC
‑3’
；Rn代表第一轮反向引物
‑
R1和第二轮反向引物
‑
R2；Fn代表第一轮正向引物
‑
F1和第二轮正向引物
‑
F2。5.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：预先将位置特异引物对混合成10
×
工作液，每种1.5 μM：PT1=1.5 μLB1
’
+1.5 μLB2+7 μLddH2O，PT2L=1.5 μLB2
’
+1.5 μLBL+7 μLddH2O；靶点一反应体系为：一轮PCR扩增的2个靶点一PCR反应产物各1 μL，3 μL引物组合工作液PT1，0.6 μL的dNTPs，0.6 μL的Super
‑
Fidelity DNA Polymerase，6μL的5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer，17.8 μL的ddH2O；靶点二反应体系为：一轮PCR扩增的2个靶点二PCR反应产物各1 μL，3 μL引物组合工作液PT2L，0.6 μL的dNTPs，0.6 μL的Super
‑
Fidelity DNA Polymerase，6 μL的5
×
Super
‑
Fidelity DNA Polymerase buffer，17.8 μL的ddH2O混匀后置于PCR仪中；PCR反应条件为：95℃，1min；95℃，10s，60℃， 15s，72℃，15 s，18个循环；72℃，10min；4℃，∞；B1
’
：5
’‑
TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTGGAATCGGCAGCAAAGG
‑3’
；B2：AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC；B2
’
：TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG；BL：AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTCCATCCACTCCAAGCTC。6.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤6中，取二轮纯化产物20
‑
70 ng，加入80
‑
100ng未切割的pYLCRISPR/Cas9
‑
DN质粒，10
×
cutsmart buffer 1.5μL，BsaI内切酶0.5 μL，用ddH2O补足体积至15 μL；混匀后置于PCR仪中37℃反应10 min进行pYLCRISPR/Cas9
‑
DN质粒酶切；向酶切后的反应体系中补加0.4 μL 10
×
T4DNA ligase buffer和0.1 μL T4 DNA ligase；再次混匀后置于PCR仪中，反应条件为37℃ 2 min，10℃ 3 min，20℃ 5 min，13个循环；37℃ 2 min；4℃ ∞。7.根据权利要求2所述的抑制番茄果实成熟的调控方法，其特征在于：步骤7中，取步骤7得到的1 μL连接产物加入到100
µ
L大肠杆菌DH5α感受态细胞中，冰上静置30 min，42℃热
激45 s，冰浴2
‑
3 min；在离心管中加入700
ꢀµ
L的LB液体培养基，置于37℃，200 rpm摇床中振荡培养60 min；培养得到的菌液5000 rpm离心2 min，弃上清600
ꢀµ
L，吸取剩余菌液均匀涂布于含有卡那霉素的LB固体培养基(每100 mL LB固体培养基加500uL 10 mg/mL卡那霉素)上，37℃倒置培养16 h；...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚改芳，张华，孙忱，胡康棣，孙红叶，苟沙沙，安欣，
申请(专利权)人：合肥工业大学，
类型：发明
国别省市：