一种基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像方法与装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像方法与装置。光束调制模块分别产生激发光与涡旋空心损耗光后耦合共轴，经过柱面透镜和照明物镜形成光片，仅激发损耗光空心位置的荧光，实现轴向超分辨成像，成像模块对样品xy平面采集并记录一系列样品荧光图像，计算机对一系列荧光图像的荧光涨落信号进行分析，并利用荧光径向涨落算法计算图像序列并重构，获得横向分辨率(～100nm)超分辨图像；移动载物台，实现对样品的z方向逐层扫描，并在每一层处完成S2的步骤，在收集完所有位置的超分辨图像后，将所有横向超分辨的图像进行三维重构，得到最终实现三维超分辨(～100nm)成像。100nm)成像。100nm)成像。

【技术实现步骤摘要】
一种基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像方法与装置


[0001]本专利技术涉及光学显微的
，具体涉及一种基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像方法与装置。

技术介绍

[0002]生物科学研究中，显微镜作为研究微观世界必不可少的工具，而光学显微镜又是观测活细胞的必备工具。光学显微镜中，光片显微成像技术是一种三维显微成像技术，它将光束形成一个薄片在样本一个方向进行扫描，扫描方向的垂直方向接收荧光并拍摄成像。这种成像方式具有高的穿透深度，低漂白以及高的成像速度等优势。但光学显微镜中，衍射极限的存在阻碍人们探索更小的细胞结构。超分辨成像技术是指突破光学衍射极限的几类方法，其中一种叫做受激辐射损耗(STED)是一种通过减小点扩散函数从而实现突破衍射极限的方法。具体的，一束激发光将光斑范围内的荧光物质激发，发出小范围荧光。于此同时再沿着光束光轴方向发射一束另一波长的高功率损耗空心光，将荧光中心附近产生荧光的荧光分子发生受激辐射，并停止发出荧光，使得荧光范围变小，成像分辨率得以提高。另一种超分辨技术叫做荧光径向涨落算法(SRRF)，根据荧光蛋白荧光信号随时间涨落(闪烁)的特点，计算这个信号的径向梯度变化从而区分出两个靠的很近的荧光分子，从而实现超分辨成像。在光片显微成像中，三个维度上都受到衍射极限的限制：xy平面分辨率约为250nm到300nm，z方向分辨率在500nm
‑
1μm，三维分辨率受限同时分辨率在xz(yz)方向上不均衡。这种分辨率难以观察生物细胞结构及亚细胞器的细节。为了提高分辨率，有研究者提出了基于干涉的晶格结构光光片成像，实现了某一方向的上超分辨成像，但无法实现各项同性的三维均衡超分辨成像。因此实现分辨率优于100nm的三维均衡超分辨成像具有极其重要的意义。

技术实现思路

[0003]鉴于现有技术的不足，本专利技术旨在于提供一种基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像方法与装置，本专利技术利用光束调制模块、光路模块、成像模块等在光片显微成像模块的基础上同时实现各向同性超分辨技术。
[0004]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0005]一种基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像装置实现成像的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0006]S1利用光束调制模块分别产生激发光与涡旋空心损耗光后耦合共轴，经过柱面透镜和照明物镜形成光片，仅激发损耗光空心位置的荧光，实现轴向超分辨成像(～100nm)；
[0007]S2成像模块对样品xy平面采集并记录一系列样品荧光图像，计算机对一系列荧光图像的荧光涨落信号进行分析，并利用荧光径向涨落算法计算图像序列并重构，获得横向分辨率(～100nm)超分辨图像；
[0008]S3移动载物台，实现对样品的z方向逐层扫描，并在每一层处完成S2的步骤，在收集完所有位置的超分辨图像后，将所有横向超分辨的图像进行三维重构，得到最终实现三维超分辨(～100nm)成像。
[0009]需要说明的是，所述步骤S1中，使用荧光蛋白、商业化有机染料探针、荧光量子点、上转换纳米探针等，其荧光探针具有荧光涨落的特性，标记待测样品。
[0010]需要指出的是，本专利技术利用受激辐射损耗在轴向产生超分辨的基本原理：
[0011]如图3所示损耗光形成的涡旋空心光嵌套于激发光束上，激发光束负责激发在焦范围内的荧光分子，而涡旋空心损耗光负责使得处于边缘一圈的荧光分子发生受激辐射，从而使得荧光猝灭，留下中心范围内的荧光分子继续发出荧光。其中，损耗光的损耗范围，随着损耗光光强的增大而向荧光中心扩散，致使激发光束激发的荧光分子从外圈逐渐减少，荧光光斑变小，从而使得分辨率提升，分辨率与损耗光强的关系由下式表示：
[0012][0013]其中d是极限分辨率，λ是损耗光波长，NA是照明物镜的数值孔径，I是损耗光光强，I
sat
是饱和光强，即使得照明范围内90％的荧光分子发光猝灭所需要的损耗光强。当复合光束通过柱透镜后就会形成夹心糖状光片，最外一层光是损耗光与激发光，负责猝灭已经由激发光片激发的荧光分子。当损耗光强大于饱和光强并增强时，复合嵌套光的夹心部分会减少，光片等效厚度变薄，从而实现光片轴向分辨率的提高。
[0014]需要说明的是，荧光径向涨落算法提升分辨率原理如图5所示：分析由成像相机拍摄得到的图像中荧光分子发射荧光具有荧光涨落性质，同时一个荧光分子的点扩散函数，呈三维高斯分布。该算法先根据其荧光涨落性质，计算点扩散函数的梯度场，最后根据得到的点扩散函数梯度场的收敛度，可以发现，经过计算之后的点扩散函数向中心收敛，并显著变小，从而实现平面超分辨。此外多张图片的互相关分析也有利于提升图像的信噪比。
[0015]本专利技术还提供了基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像装置，所述装置包括光束调制模块、光路模块和成像模块，其中：
[0016]所述光束调制模块包括第一激光器、第二激光器、望远镜系统、螺旋相位板、空间光调制器和反射镜组成；第一激光器是一台低功率的连续光或脉冲激光器用于产生第一波长的激发光，第二激光器是一台连续光或脉冲激光器用于产生第二波长的损耗光；望远镜系统分别置于第一激光器、第二激光器之后；空间光调制器分别部署在望远镜模块之后，用于激发光与损耗光的整形以产生实验所需的特殊光束，如，高斯光束，贝塞尔光束，艾里光束等；
[0017]光路模块由二向色镜、柱面透镜、反射镜、照明物镜组成，其中调制好的激发光与损耗光通过二向色镜共轴耦合；经过反射镜调整，将复合光束照射至柱面透镜和照明物镜，形成光片，激发光可以激发荧光，损耗光可以损耗荧光，即抑制荧光，因此共轴耦合光束通过柱透镜形成的光片具有超薄的有效激发厚度，从而最终实现轴向超分辨成像；
[0018]成像模块由载物台、检测物镜、荧光滤色片、镜筒透镜、成像相机以及计算机组成；载物台的作用是移动样品使得照明光片激发样品的每一处荧光，实现三维成像；样品辐射荧光会出现荧光信号随时间涨落现象，进入检测物镜后，经过荧光滤色片滤除不需要的散射光以及其它干扰光的信号；镜筒透镜将预处理过的荧光涨落信号聚焦成像于成像相机感
光面；成像相机记录荧光涨落信息获得图像序列，计算机通过荧光径向涨落算法计算处理该图像序列并重构，获得横向分辨率超分辨图像；在收集完毕并计算处理完所有层面的横向超分辨图像后，经由计算机将所有图像进行三维重构，形成所需要的三维超分辨图像。
[0019]需要说明的是，在照明光片将所在平面的样品覆盖完毕并成像之后，所述载物台才再继续沿着轴向移动一层，依次反复循环移动，直至样品所有部分荧光都被激发之后完成成像工作。
[0020]需要说明的是，在光束调整模块的损耗光调制光路中，螺旋相位板位于空间光调制器之后，用于将损耗光再次整形并调制成涡旋空心光束，经过反射镜进入后续光路模块。
[0021]需要说明的是，所述载物台由三维电动支撑架和样品室组成；三维电动支撑架沿x，y，z三个方向根据计算机的控制自由移动并可以沿着支撑轴旋转本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像装置实现成像的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1利用光束调制模块分别产生激发光与涡旋空心损耗光后耦合共轴，经过柱面透镜和照明物镜形成光片，仅激发损耗光空心位置的荧光，实现轴向超分辨成像(～100nm)；S2成像模块对样品xy平面采集并记录一系列样品荧光图像，计算机对一系列荧光图像的荧光涨落信号进行分析，并利用荧光径向涨落算法计算图像序列并重构，获得横向分辨率(～100nm)超分辨图像；S3移动载物台，实现对样品的z方向逐层扫描，并在每一层处完成S2的步骤，在收集完所有位置的超分辨图像后，将所有横向超分辨的图像进行三维重构，得到最终实现三维超分辨(～100nm)成像。2.根据权利要求1所述的基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像方法，其特征在于，所述步骤S1中，使用荧光蛋白、商业化有机染料探针、荧光量子点、上转换纳米探针等，其荧光探针具有荧光涨落的特性，标记待测样品。3.根据权利要求1所述的基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像方法，其特征在于，本发明利用受激辐射损耗在轴向产生超分辨的基本原理：损耗光形成的涡旋空心光嵌套于激发光束上，激发光束负责激发荧光分子，而涡旋空心损耗光负责使周围已激发荧光分子发生受激辐射而猝灭荧光，光片等效厚度变薄，从而实现光片轴向分辨率的提高。4.根据权利要求1所述的基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像方法，其特征在于，荧光径向涨落算法提升横向分辨率原理，该算法先根据荧光探针随时间的荧光涨落性质，计算其点扩散函数的梯度场，最后根据得到的点扩散函数梯度场的收敛度，可以发现，经过计算之后的点扩散函数向中心收敛，并显著变小，从而实现横向超分辨。此外多张图片的互相关分析也有利于提升图像的信噪比。5.一种利用权利要求1
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4任一所述的基于荧光径向涨落算法的三维光片超分辨成像装置，其特征在于，所述装置包括光束调制模块、光路模块和成像模块，其中：所述光束调制模块包括第一激光器、第二激光器、望远镜系统、螺旋相位板、空间光调制器和反射镜组成；第一激光器是一台低功率的连续光或脉冲激光器用于产生第一波长的激发光，第二激光器是一台连续光或脉冲激光器用于产生第二...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡雨言，王保举，刘畅，詹求强，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：