一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置，本发明专利技术搭建了由激发光生成模块、双焦点调制模块、多光子显微扫描模块、反射镜样品模块、光电探测模块组成的显微成像装置，在入射激光激发下，实现无光漂白、低光毒性、低复杂度、低成本、易用的三维无旁瓣各向同性超/高分辨显微技术。术。术。

【技术实现步骤摘要】
一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置


[0001]本专利技术涉及光学显微的
，具体涉及一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置

技术介绍

[0002]长期以来,远场光学荧光显微镜凭借其非接触、无损伤、可探测样品内部等优点,一直是生命科学中最常用的观测工具。由于光学衍射极限的存在，光斑沿光轴方向被拉长，这导致传统荧光显微镜轴向分辨率远低于横向分辨率。这意味着其三维分辨率并不是各向同性的，因而三维成像质量受到影响。三维均衡的超分辨成像对于生物医学、微纳光学等诸多交叉学科具有重要意义。因此，诸多研究者对三维各向同性的光学超分辨方法开展了大量研究。
[0003]有研究者提出利用双物镜搭建4Pi显微镜，通过增加物镜的接收角(等效增加物镜的NA),可以减小点扩散函数的尺度从而提高分辨率。双物镜4Pi显微镜在轴向上压缩点扩散函数而并未提高横向分辨率，这造成了轴向与横向分辨率的失衡，成像结果畸变严重；双物镜4Pi显微镜的旁瓣效应明显，其纵向旁瓣约为主瓣的40％～45％,实验中甚至达到70％以上，即使利用针孔滤波、反卷积技术等手段，旁瓣的强度仍然保持在30％左右；双物镜4Pi显微镜对于样品要求严苛，由于干涉主瓣无法移动，只能用于成像薄透明样品；双物镜4Pi显微镜的对准要求极为严苛，系统光路复杂，微小的扰动对于成像结果具有明显影响。因此，如果能克服双物镜4Pi显微镜的缺陷，开发一种低成本的、简易的、无旁瓣的三维各向同性显微方法，这对于增强我国在超分辨显微成像基础研究和仪器开发的国际影响力将具有重要的意义。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术旨在提供一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，所述方法包括以下步骤：
[0007]S1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光，再经双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入双焦点调制系统，经空间光调制器进行波前调制得到沿轴向分布的前后两个焦点；
[0008]S2前后两个焦点在物镜端出射，由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场；
[0009]S3将荧光探针标记的样品置于反射镜表面，利用干涉光场对其进行X、Y、Z方向逐点扫描，再用光电探测器检测每点对应的荧光信号，结合非线性效应可得到三维无旁瓣的
所述各向同性高/超分辨荧光图像。
[0010]需要说明的是，所述反射镜置于沿光轴分布前后焦点的中点处，物镜出射前焦点的入射光场和物镜出射后焦点经由反射镜反射的反射光场在前焦点位置处收敛；其中，所述干涉光场分布的位置随前焦点和反射镜相对位置的变化而发生改变，通过改变前后两个焦点的距离，保证干涉光场的轴向移动，实现轴向高/超分辨成像。
[0011]需要指出的是，本专利技术的激光至少包括连续型近红外光(波长：700nm
‑
1100nm)、飞秒型近红外光(波长：700nm
‑
1100nm)、连续型可见光(波长：400nm
‑
700nm)中的一种或多种。
[0012]需要指出的是，本专利技术的所述反射镜至少包括镀铝膜平面反射镜，镀银膜平面反射镜，镀金膜平面反射镜中的一种且对光场具有半波损失(π的相位差)。
[0013]需要说明的是，干涉光场沿中心光斑(主瓣)对称分布，纵向光斑(旁瓣)垂直于光轴强逐级减弱；其中，干涉光场主瓣的轴向半高宽被大幅度压缩，其轴向半高宽较该激发波长激光经物镜聚焦后光斑轴向半高宽提高4
‑
7倍；第一级旁瓣的强度为干涉光场主瓣的一半，随着级次提高，旁瓣强度降低。
[0014]需要说明的是，通过主瓣高/超压缩的半高宽，实现Z方向逐层扫描，实现距离镜面不同距离的连续轴向高/超分辨成像。
[0015]需要说明的是，所述荧光探针包含稀土掺杂上转换纳米颗粒，其非线性阶数n≥4，可以通过连续型/飞秒型近红外光匹配其激活离子Tm
3+
的激发态吸收能量，Nd
3+
或Yb
3+
作为敏化剂共掺杂上转换纳米颗粒，可分别被波长为980nm，795nm、730nm激光激发产生四光子荧光辐射过程，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣高分辨成像。
[0016]需要说明的是，所述荧光探针也可以是包括量子点或有机染料中的一种。
[0017]需要说明的是，所述荧光探针还可以是用雪崩荧光纳米探针产生光子雪崩上转换荧光，产生高阶非线性效应n≥28，以获取更高阶的非线性效应，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣各向同性超高分辨成像。
[0018]本专利技术还提供一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像的装置，所述装置包括激发光生成模块、双焦点调制模块、多光子显微扫描模块、反射镜样品模块和光电探测模块；其中，所述激光发生模块用于生成作为激发光的连续型近红外光、飞秒型近红外光和连续型可见光，激发光经整形后进入双焦点调制模块进行波前调制得到沿着光轴分布的前后两个焦点，经由多光子显微扫描模块聚焦到反射镜样品模块产生双焦点干涉，利用高阶荧光探针的非线性得到无旁瓣各向同性的中心光斑，对样品进行不同区域的扫描，相关荧光信号由光电探测模块进行收集。
[0019]需要说明的是，还包括沿所述激光发生模块中的激光器所发射入射光束光轴方向依次放置的滤光片、准直扩束系统、二分之一波片以及偏振片；激光器产生稳定、单一波峰的激光，经由滤光片滤除入射无光杂光，进入准直扩束系统镜扩大激发光斑尺寸，提高激发光功率利用率。入射激光经由二分之一波片与偏振片配合调节功率，实现样品相应激活离子激发态吸收的匹配。
[0020]需要说明的是，所述双焦点调制模块包括沿激光束前进方向放置的反射镜与空间光调制器；反射镜将通过激光发生模块入射的准直光束反射至空间光调制器，其调制焦平面与到物镜的后焦平面光学共轭。通过输入不同的相位调制，得到沿光轴分布距离不同的
前后两个焦点，用于调制后续的单物镜干涉成像光场。
[0021]需要说明的是，所述多光子显微扫描模块包括沿激光束前进方向依次放置的扫描振镜、扫描透镜、管镜、高反低透二向色镜和物镜；扫描振镜控制激光束的光路偏转对样品进行二维扫描，扫描透镜与场镜对经过扫描振镜出射的激光束进行聚焦和准直，高反低透二向色镜能反射近红外激发光以及透射样品荧光，用于分离激发光与荧光，由双焦点调制模块的入射光场经过物镜聚焦到反射镜样品模块。
[0022]需要说明的是，所述反射镜样品模块从上往下依次是玻璃/硅基底、镀银/金/铝层、二氧化硅保护层、具有荧光探针标记的样品和盖玻片；经由波前调制得到的沿光轴分布的的前后两个焦点在物镜出射端由于反射镜的作用，前本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法及装置，其特征在于，所述方法包括以下步骤：S1激光器发出一束稳定的激光，该激光经过滤光片滤去其它波长激光，再经双凸透镜准直扩束、针孔滤波器滤波整形后，进入双焦点调制系统，经空间光调制器进行波前调制得到轴向分布的前后两个焦点；S2前后两个焦点在物镜端出射，由于反射镜的作用，前焦点的入射光场和后焦点的反射光场在前焦点位置处收敛，在镜表面形成明暗相间的干涉光场；S3上转换荧光发射与激发光强度具有高阶非线性响应关系，通过所设计荧光探针的多光子非线性荧光效应，荧光点扩散函数在X、Y、Z方向上被大幅压缩，分辨率获得大幅提高，突破衍射极限；S4将荧光探针标记的样品置于反射镜表面，利用干涉光场对其进行X、Y、Z方向逐点扫描，再用光电探测器检测每点对应的荧光信号，结合非线性效应可得到三维无旁瓣的所述各向同性高/超分辨荧光图像。2.根据权利要求1所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，所述反射镜置于沿光轴分布前后焦点的中点处，物镜出射前焦点的入射光场和物镜出射后焦点经由反射镜反射的反射光场在前焦点位置处收敛；其中，所述干涉光场分布的位置随前焦点和反射镜相对位置的变化而发生改变，通过改变前后两个焦点的距离，保证干涉光场的轴向移动，实现轴向高/超分辨成像。3.根据权利要求1或2所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，干涉光场沿中心光斑(主瓣)对称分布，纵向光斑(旁瓣)垂直于光轴强逐级减弱；其中，干涉光场主瓣的轴向半高宽被大幅度压缩，其轴向半高宽较该激发波长激光经物镜聚焦后光斑轴向半高宽提高4
‑
7倍；第一级旁瓣的强度为干涉光场主瓣的一半，随着级次提高，旁瓣强度降低。4.根据权利要求3所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，通过主瓣高/超压缩的半高宽，实现Z方向逐层扫描，实现距离镜面不同距离的连续轴向高/超分辨成像。5.根据权利要求3所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，所述荧光探针包含稀土掺杂上转换纳米颗粒，其非线性阶数n≥4，可以通过连续型/飞秒型近红外光匹配其激活离子Tm
3+
的激发态吸收能量，Nd
3+
或Yb
3+
作为敏化剂共掺杂上转换纳米颗粒，可分别被波长为980nm，795nm、730nm激光激发产生四光子荧光辐射过程，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣高分辨成像。6.根据权利要求1所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像方法，其特征在于，所述荧光探针还可以是用雪崩荧光纳米探针产生光子雪崩上转换荧光，产生高阶非线性效应n≥28，以获取更高阶的非线性效应，消除干涉光场的旁瓣并提高横向分辨率，突破衍射极限，实现三维无旁瓣各向同性超高分辨成像。7.一种实现如权利要求1
‑
6任一所述的基于高阶非线性荧光的三维各向同性单物镜超分辨成像装置，其特征在于，所述装置包括激发光生成模块、双焦点调制模块、多光子...

【专利技术属性】
技术研发人员：王保举，刘畅，潘彬雄，蔡雨言，詹求强，
申请(专利权)人：华南师范大学，
类型：发明
国别省市：