离子交换膜制造技术

[课题]本发明专利技术的课题是，提供将存在于血清等生物体试样中的外泌体简便且低成本地分离纯化的离子交换膜。[解决手段]本发明专利技术是纤维素系聚合物的2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分被具有正电荷的化合物取代的纤维素系离子交换膜。另外，本发明专利技术是一种外泌体的纯化方法，其包括：通过使包含外泌体的试样从所述纤维素系离子交换膜进行膜渗透来吸附所述外泌体的工序；使清洗液与所述膜接触来除去杂质的工序；使洗脱液与所述膜接触来脱附所述外泌体的工序。脱附所述外泌体的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】离子交换膜


[0001]本专利技术涉及用于高纯度地纯化外泌体的离子交换膜。

技术介绍

[0002]外泌体是由动物、植物、菌类等真核细胞放出的直径约30
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150nm的细胞外囊泡，已知其显示出在体液中将蛋白质、mRNA、miRNA等内包并传播等、对于细胞间的信息传递而言重要的功能。近年来，已经启示外泌体参与了癌转移的亢进、癌恶化，并且已经开发了以由源自癌的外泌体表达的miRNA作为肿瘤标记物的、用于判明癌进展的预测、转移、预后的生物标记物等、着眼于外泌体的诊断用标记物。
[0003]另外，外泌体被期待通过从生物体分离纯化，从而作为将细胞内的核酸、蛋白质等内包的源自生物的输送体而应用于药物递送系统(DDS)。因此，要求将外泌体高纯度地分离纯化的技术。
[0004]作为将外泌体分离纯化的方法，可举出离心分离法、密度梯度离心法等超离心法、使用聚乙二醇等聚合物的沉淀法、尺寸排阻色谱、亲和色谱等色谱法。作为通常的方法，可举出超离心分离法，有时通过密度梯度离心来得到高纯度的外泌体。然而，超离心分离法存在由于离心过程中外泌体的结构变化、破坏导致的品质的降低、回收率低等问题。
[0005]作为除上述的超离心法以外的分离纯化法，已知使用过滤器的过滤法。该方法通过使用具有适于外泌体的分离的膜孔径的过滤膜，能够进行夹杂物与外泌体的分离，因此，能够比超离心法更简便地进行。然而，由于在过滤器表面因夹杂物而产生堵塞，因此不适合大量的分离纯化，并且难以回收被过滤器捕捉的外泌体。
[0006]作为从过滤器以高纯度回收外泌体的方法，专利文献1中公开了使用由多孔体形成的开孔基盘的分离回收方法。该专利技术能够以高捕捉率回收外泌体，但在回收工序中，需要赋予超声波振动、施加电场或施加压力。
[0007]另外，作为以高纯度回收外泌体的方法，已知有使用涂覆有抗体的磁性珠的方法、使用担载有肽的磁性珠的方法(专利文献2、3)。在使用磁性珠的情况下，还需要磁性材料的原料成本，回收方法也产生限制。
[0008]另外，专利文献4中公开具有离子交换基团的纤维素膜。该离子交换膜被公开为：利用碱等将乙酸纤维素多孔膜进行水解，接下来导入二乙基氨基乙基(DEAE基)等阳离子性基团而得的膜。
[0009]现有技术文献
[0010]专利文献
[0011]专利文献1：国际公开第2017/154951号小册子
[0012]专利文献2：日本特开2017
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067706号公报
[0013]专利文献3：国际公开第2019/039179号小册子
[0014]专利文献4：日本特开平7
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081022号公报

技术实现思路

[0015]专利技术要解决的问题
[0016]本专利技术的目的是解决上述技术问题，其目的在于，提供能够将外泌体高纯度且低成本地分离纯化的离子交换膜。
[0017]用于解决问题的方案
[0018]本专利技术人进行了深入研究，结果发现，通过以下所示的方案能够解决上述问题，从而获得本专利技术。
[0019]即，本专利技术包含以下的构成。
[0020]1.一种纤维素系离子交换膜，其是纤维素系聚合物的2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分被具有正电荷的化合物取代而得到的。
[0021]2.根据1所述的纤维素系离子交换膜，其中，所述具有正电荷的化合物为叔胺和/或季铵。
[0022]3.根据1或2所述的纤维素系离子交换膜，其最小孔径为50nm～600nm。
[0023]4.根据1～3中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其离子交换容量为0.03meq/g～0.9meq/g。
[0024]5.根据1～4中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其平均厚度为10μm～1000μm。
[0025]6.根据1～5中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其在pH6.5～7.5的范围内测定的Zeta电位为10mV～70mV。
[0026]7.根据1～6中任一项所述的纤维素系离子交换膜，该纤维素系离子交换膜的细孔径为30nm以上的细孔的比表面积为8m2/g以上。
[0027]8.根据1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其中，所述离子交换膜为细孔径从一个表面朝向另一个表面增大的非对称结构。
[0028]9.一种外泌体纯化用的器件，其包含1～8中任一项所述的纤维素系离子交换膜。
[0029]10.1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜的制造方法，在制造包含纤维素系聚合物的多孔基材膜后，将2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分取代为具有正电荷的化合物。
[0030]11.一种外泌体的纯化方法，其包括：使用1～7中任一项所述的纤维素系离子交换膜或9所述的器件，通过使包含外泌体的试样进行膜渗透来吸附所述外泌体的工序；使清洗液与所述膜接触来除去杂质的工序；使洗脱液与所述膜接触来脱附所述外泌体的工序。
[0031]专利技术效果
[0032]本专利技术的离子交换膜通过在膜厚方向上具有孔径从一个表面朝向另一个表面扩大或缩小的、所谓的非对称结构，从而能够在控制生物体液中所含的尺寸大的凋亡小体等夹杂物的膜透性的同时，提高直径30
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150nm的外泌体的分离性。进一步地，通过含有正电荷基团，能够静电性地捕捉负电荷性的外泌体，能够从培养上清液中简便且高纯度地将外泌体进行分离纯化。
附图说明
[0033]图1是示出使用本专利技术的离子交换膜的外泌体分离的概念的示意图。
[0034]图2是制造例1的多孔基材膜的扫描型电子显微镜照片。
[0035]图3是本专利技术的离子交换膜的扫描型电子显微镜的照片。
具体实施方式
[0036]本专利技术是纤维素系聚合物的2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分被具有正电荷的化合物取代而得到的纤维素系离子交换膜。
[0037]本专利技术中，作为纤维素系聚合物，可举出乙酸纤维素、丙酸纤维素、丁酸纤维素、乙酸丙酸纤维素、乙酸丁酸纤维素、乙酸月桂酸纤维素、乙酸油酸纤维素、及乙酸硬脂酸纤维素等，从具有正电荷的化合物的导入的容易性的方面出发，优选使用乙酸纤维素。乙酸纤维素有乙酰化度、分子量不同的市售品，更优选使用乙酰化度为52～62左右的乙酸纤维素或三乙酸纤维素。
[0038]本专利技术中，作为具有正电荷的化合物，优选使用下述式(I)所示的叔胺或下述式(II)所示的季铵化合物。式中，R1～R3表示相同或不同的氢原子、或者碳原子数1～10的直链或支链状烷基，亚甲基的n表示1～5的整数。式中，X表示选自氟、氯、溴、碘等卤素原子、甲苯磺酸酯、三氟甲磺酸酯、甲磺酸酯等磺酸酯等离去基团、烷氧基甲硅烷基、硅烷醇等甲硅烷基、环氧基、异氰酸酯基、羧酸基中的1种以上。具有正电荷的化合物可以使用任意的取代基X，从原料获取的容易性的方面出发，优选为X具有氯、甲硅烷基、环氧基的化合物。
[0039][化1][0040][本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种纤维素系离子交换膜，其是纤维素系聚合物的2位、3位及6位中任意位置的羟基或乙酰基的至少一部分被具有正电荷的化合物取代而得到的。2.根据权利要求1所述的纤维素系离子交换膜，其中，所述具有正电荷的化合物为叔胺和/或季铵。3.根据权利要求1或2所述的纤维素系离子交换膜，其最小孔径为50nm～600nm。4.根据权利要求1～3中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其离子交换容量为0.1meq/g～0.9meq/g。5.根据权利要求1～4中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其平均厚度为10μm～1000μm。6.根据权利要求1～5中任一项所述的纤维素系离子交换膜，其在pH6.5～7.5的范围内测定的Zeta电位为10mV～70mV。7.根据权利要求1～6中任一项所述的纤维素系离子交换膜，该纤维素系离子交换膜...

【专利技术属性】
技术研发人员：桧垣绫乃，白马弘文，
申请(专利权)人：东洋纺株式会社，
类型：发明
国别省市：