一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用，属于家畜繁殖技术领域。本发明专利技术公开的一种猪卵母细胞体外成熟培养液，在基础培养液中添加0.04～0.05mg/mL或0.14～0.18mg/mL的柠檬酸。本发明专利技术可有效获得大量高质量卵母细胞，为体外受精、孤雌激活、核移植制备克隆胚胎等技术提供支持，并在良种家畜扩繁、动物模型构建、转基因动物生产等方面发挥重要意义。重要意义。重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用


[0001]本专利技术涉及家畜繁殖
，更具体的说是涉及一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用。

技术介绍

[0002]猪卵母细胞体外成熟培养是家畜繁殖技术中的重要环节。成熟卵母细胞广泛应用于体外受精、孤雌激活、核移植制备克隆胚胎等
，进一步可为良种家畜扩繁、动物模型构建、转基因动物生产等提供支持。但目前猪卵母细胞体外成熟过程中存在成熟率、发育质量不一致等问题，制约了后续的基础研究及生产实际使用，因此提高猪卵母细胞体外成熟刻不容缓。导致卵母细胞体外成熟效率低的原因在于与体内成熟相比，母体内环境的不同及众多其他影响因素，体外成熟培养体系无法完全还原体内微环境，因此急需建立一种更稳定，卵母细胞成熟效率更高的体外培养体系。
[0003]目前，体外成熟过程中添加何种有益于卵母细胞发育的核心因子尚不明确，普遍认为有助于卵母细胞成熟的因子包括激素、生长因子、细胞因子和其他组分等。
[0004]因此，提供一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种猪卵母细胞体外成熟培养液，所述猪卵母细胞体外成熟培养液在基础培养液中添加0.04～0.05mg/mL或0.14～0.18mg/mL的柠檬酸。
[0008]进一步，所述猪卵母细胞体外成熟培养液在基础培养液中添加0.048mg/mL或0.144mg/mL的柠檬酸。
[0009]进一步，所述基础培养液以不含HEPES的M199培养液为基础，添加90％体积分数TCM199、10％体积分数猪卵泡液，同时补充添加1mg/mL的L
‑
半胱氨酸、0.44mg/mL的丙酮酸钠、10ng/mL的表皮生长因子、50ng/mL的胰岛素、5IU/mL的促性腺激素、5IU/mL的绒毛膜促性激素。
[0010]进一步，所述的一种猪卵母细胞体外成熟培养液在提高猪卵母细胞体外成熟率及发育质量中的应用。
[0011]课题组前期通过代谢组筛选得出体内卵泡液中柠檬酸水平与卵母细胞发育潜力呈正相关，同时也证实了柠檬酸作为三羧酸循环中起始能量底物，有助于卵母细胞的成熟发育过程。三羧酸循环是需氧生物体内普遍存在的代谢途径，调控生物体代谢生长发育，柠檬酸通过增强三羧酸循环代谢途径，提高ATP水平，促进Ca
2+
振荡，有助于提高卵母细胞活化，进而提高卵母细胞体外成熟，在卵母细胞活化及后续胚胎发育中起到不可替代的作用。
[0012]柠檬酸在猪卵母细胞基础培养液中的应用，具体为柠檬酸在提高猪卵母细胞成熟
率和发育质量中的应用，即在基础培养液中添加柠檬酸，可有效提高猪卵母细胞体外成熟率及发育质量，保证猪卵母细胞线粒体活性，提高卵母细胞纺锤体、染色体正常比例，提高囊胚细胞数，进而获得大量高质量体外成熟卵母细胞，为基础科学研究及生产实践提供支持。
[0013]经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术公开提供了一种猪卵母细胞体外成熟培养液及其应用，通过在基础培养液中添加0.048mg/mL的柠檬酸，可大量提高小卵泡卵母细胞的利用率，成熟率提高近20％，纺锤体正常比例提高近30％，囊胚细胞数提高近25％。而采用的0.144mg/mL的柠檬酸，卵母细胞成熟率提高15％，囊胚细胞数提高近35％。该方案可有效获得大量高质量卵母细胞，为体外受精、孤雌激活、核移植制备克隆胚胎等技术提供支持，并在良种家畜扩繁、动物模型构建、转基因动物生产等方面发挥重要意义。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0015]图1附图为本专利技术卵母细胞体外成熟过程中基础培养液中添加或不添加柠檬酸卵丘扩张程度；对照组箭头所指为卵丘细胞扩展程度低，处理组(柠檬酸浓度为0.048mg/mL)为卵丘细胞扩展程度明显增加；每组两张图作展示用，比例尺为200μm；
[0016]图2附图为本专利技术卵母细胞体外成熟过程中基础培养液中添加(柠檬酸浓度为0.048mg/mL)或不添加柠檬酸卵母细胞MII时期第一极体外排及卵周隙形态；每组两张图作展示用；箭头所指为第一极体，比例尺为50μm；
[0017]图3附图为本专利技术卵母细胞体外成熟过程中基础培养液中添加或不添加柠檬酸卵母细胞成熟后线粒体活性情况；
[0018]其中，A为对照组、处理组(基础培养液中添加0.048mg/mL柠檬酸)MII期卵母细胞线粒体活性荧光表达情况，使用共聚焦显微镜拍照；每组两张图作展示用；比例尺为50μm；B为对照组(Ctrl)、处理组(基础培养液中添加0.048mg/mL、0.144mg/mL柠檬酸)MII期卵母细胞线粒体活性荧光定量水平，使用软件Image J分析；
[0019]图4附图为本专利技术卵母细胞体外成熟过程中基础培养液中添加或不添加柠檬酸卵母细胞成熟后纺锤体和染色体形态情况；
[0020]其中，A为对照组、处理组(基础培养液中添加0.048mg/mL柠檬酸)MII期卵母细胞纺锤体形态情况，使用共聚焦显微镜拍照；每组两张图作展示用；比例尺为50μm；B为对照组(Ctrl)、处理组(基础培养液中添加0.048mg/mL、0.144mg/mL柠檬酸)MII期卵母细胞纺锤体形态正常比例百分比，对照、处理均设置三组重复，每组重复检测15～20枚MII期卵母细胞，最后结果差异性统计使用SPSS统计软件分析；
[0021]图5附图为本专利技术卵母细胞体外成熟过程中基础培养液中添加或不添加柠檬酸卵母细胞成熟后囊胚细胞数情况。
具体实施方式
[0022]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0023]不含HEPES的M199培养液为赛默飞世尔科技公司的产品，其他无特殊说明所需试剂均为西格玛奥德里奇公司产品。胚胎水为胚胎培养配置所需试剂的溶剂，来源sigma，W1503
‑
500ML。
[0024]由于从受精到胚胎着床这一过程中，胚胎所需能量均由卵子线粒体提供，随着动物年龄增长、线粒体数量逐渐减少、功能不断衰弱，导致卵子质量变差、胚胎染色体异常，目前猪卵母细胞体外培养成熟时，卵巢来源个体母猪年龄差异明显、个体间存在较大差异，造成卵母细胞体外成熟率低、发育不一致，柠檬酸(三羧酸)循环作为三大营养素最终代谢通路，在促进卵母细胞成熟、保本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养液在基础培养液中添加0.04～0.05mg/mL或0.14～0.18mg/mL的柠檬酸。2.根据权利要求1所述的一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述猪卵母细胞体外成熟培养液在基础培养液中添加0.048mg/mL或0.144mg/mL的柠檬酸。3.根据权利要求1或2所述的一种猪卵母细胞体外成熟培养液，其特征在于，所述基础培养液以不...

【专利技术属性】
技术研发人员：苗义良，周吉隆，范振港，何海楠，刘鑫，张霞，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：