猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法，包括如下步骤：步骤1：准备产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞；步骤2：取仔猪空肠前段组织进行处理得到肠隐窝；步骤3：用稀释后的基质胶重悬肠隐窝，将产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞、肠隐窝接种于提前温育的孔板上，于孔板中加入类器官生长培养基，培养。本发明专利技术的培养基针对于猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的生长特点，选用了多种生长因子成份进行调和、优化了孔板中大肠杆菌和巨噬细胞的浓度，经过不断优化培养基中生长因子的配比，使猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌、巨噬细胞能够有效地进行接触性共培养。养。养。

【技术实现步骤摘要】
猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法。

技术介绍

[0002]传统的单层细胞模型和动物模型存在根本性缺陷，单层细胞模型只附着于培养皿上单层生长，它不能模拟正常机体细胞复杂的生存环境(Rahmani et al.,2019)。动物模型虽可模拟体内的生存环境，但其具有培养周期长、费用高等问题，无法满足猪精准营养研究需要(Almeqdadi et al.,2019)。因此近年来研究者们开始关注类器官培养技术，类器官是3D细胞培养，生长在细胞外基质中的干细胞可利用自我分化的能力形成三维腺腔样结构，其能够高度还原肠道上皮等组织结构特异性，更准确地模拟体内的微环境，真实反应细胞异质性与多样性，以及细胞间、细胞与基质间的相互作用(Gjorevski et al.,2016；Lukonin et al.,2020)。
[0003]研究表明，肠道干细胞可以在体外分化建立完整的隐窝
‑
绒毛轴(Sato et al.,2009)。通过加入适当的生长因子，肠道干细胞可以在基质胶中存活下来。透过显微镜观察，可以发现许多立体的空心球状结构，它们保留了类似于动物本身的肠道上皮结构，所以被称之为肠道类器官，该培养模型已被证明是在分子水平上研究肠黏膜损伤修复的强大系统(Yu et al.,2017)。
[0004]CN201811066368.2公开了一种猪肠道隐窝分离和3D类器官培养的方法，猪肠道3D类器官的培养，所用培养液为含生长因子的DMEM/F12培养液，其配方为：在DMEM/F12培养液中加入100ng/ml的Wnt3a，500ng/ml的R
‑
spondin1，100ng/ml的Noggin，1
×
的血清替代物B27supplement和N2supplement，1mmol/L n
‑
Acetyl Cysteine，50ng/ml的重组人表皮生长因子(EGF),10μmol/L的SB202190，即P38抑制剂，500nmol/L的LY2157299，即TGFβ抑制剂，10μmol/L的Y27632，即ROCK1抑制剂，10mmol/L的Nicotinamide，100μg/ml的Primocin。
[0005]在采用肠隐窝和大肠杆菌进行共培养的过程中，会发现肠隐窝凋亡，导致实验失败。
[0006]本案解决的技术问题是：如何实现肠隐窝和大肠杆菌或巨噬细胞共培养，以提高培养成功率。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的是在于提供一种猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法，本专利技术的培养基针对于猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的生长特点，选用了多种生长因子成份进行调和、优化了孔板中大肠杆菌的浓度，经过不断优化培养基中生长因子的配比，使猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌能够有效地进行接触性共培养。
[0008]为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法，包括如下步骤：
[0009]步骤1：准备产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞；
[0010]步骤2：取仔猪空肠前段组织进行处理得到肠隐窝；
[0011]步骤3：采用类器官生长培养基稀释减生长因子的基质胶，用稀释后的基质胶重悬肠隐窝，按照低于1*105个产肠毒素性大肠杆菌/10ul或500
‑
1000个巨噬细胞/10ul、10
‑
20个肠隐窝/10ul接种于提前温育的孔板上，静置，使基质胶凝固，于孔板中加入类器官生长培养基，置于37℃含5％CO2培养箱中，培养，每两天更换一次类器官生长培养基；
[0012]所述类器官生长培养基含如下成分：
[0013]基础培养基：Advanced DMEM/F12；
[0014]L
‑
WRN cells条件性培养基40
‑
50vol％；
[0015]100X规格的N2 0.9
‑
1.1倍体积；
[0016]100X规格的B27
‑
supplement 0.9
‑
1.1倍体积；
[0017]45
‑
55ng/ml EGF；
[0018]9‑
11μM Y27632；
[0019]0.45
‑
0.55μM LY2157299；
[0020]9‑
11μM SB202190；
[0021]9‑
11μM CHIR99021；
[0022]0.9
‑
1.1mM HEPES；
[0023]0.9
‑
1.1mM N
‑
acetylcysteine；
[0024]100X规格的Glutamax 0.9
‑
1.1倍体积；
[0025]0.9
‑
1.1mM valproic acid。
[0026]在上述的猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法中，含如下成分：含如下成分：
[0027]基础培养基：Advanced DMEM/F12；
[0028]L
‑
WRN cells条件性培养基40
‑
50vol％；
[0029]100X规格的N2 1倍体积；
[0030]100X规格的B27
‑
supplement 1倍体积；
[0031]50ng/ml EGF；
[0032]10μM Y27632；
[0033]0.5μM LY2157299；
[0034]10μM CHIR99021；
[0035]10μM SB202190；
[0036]1mM HEPES；
[0037]1mM N
‑
acetylcysteine；
[0038]100X规格的Glutamax 1倍体积；
[0039]1mM valproic acid。
[0040]在上述的猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法中，所述步骤1具体为：
[0041]实验前一天准备灭菌的LB液体培养基、LB固体培养基、灭菌ddH2O；
[0042]将产肠毒素性大肠杆菌ETEC K88接种至液体培养基中，选取对数期的产肠毒素性大肠杆菌ETEC K88处理细胞，用PBS清洗ETEC K88，然后用DMEM进行稀释。
[0043]在上述的猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法中，所述步骤2具体为：
[0044]将仔猪空肠前段组织冲洗后迅速放入含冰本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：准备产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞；步骤2：取仔猪空肠前段组织进行处理得到肠隐窝；步骤3：采用类器官生长培养基稀释减生长因子的基质胶，用稀释后的基质胶重悬肠隐窝，按照低于1*105个产肠毒素性大肠杆菌/10ul或500
‑
1000个巨噬细胞/10ul、10
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20个肠隐窝/10ul接种于提前温育的孔板上，静置，使基质胶凝固，于孔板中加入类器官生长培养基，置于37℃含5％CO2培养箱中，培养，每两天更换一次类器官生长培养基；所述类器官生长培养基含如下成分：基础培养基：Advanced DMEM/F12；L
‑
WRN cells条件性培养基40
‑
50vol％；100X规格的N2 0.9
‑
1.1倍体积；100X规格的B27
‑
supplement 0.9
‑
1.1倍体积；45
‑
55ng/ml EGF；9
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11μM Y27632；0.45
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0.55μM LY2157299；9
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11μM SB202190；9
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11μM CHIR99021；0.9
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1.1mM HEPES；0.9
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1.1mM N
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acetylcysteine；100X规格的Glutamax 0.9
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1.1倍体积；0.9
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1.1mM valproic acid。2.根据权利要求1所述的猪肠类器官与产肠毒素性大肠杆菌或巨噬细胞共培养体系的构建方法，其特征在于，含如下成分：基础培养基：Advanced DMEM/F12；L
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WRN cells条件性培养基40
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50vol％；100X规格的N2 1倍体积；100X规格的...

【专利技术属性】
技术研发人员：曹舒婷，王丽，高靖春，肖昊，胡胜兰，吴胜男，蒋宗勇，侯磊，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，
类型：发明
国别省市：