一种基于实时荧光定量PCR技术检测嗜血分枝杆菌的方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于实时荧光定量PCR技术检测嗜血分枝杆菌的方法及其应用。本发明专利技术还公开了快速鉴定嗜血分枝杆菌的引物组，该引物组由引物1、引物2和探针组成，其核苷酸序列分别如序列表中的序列1、序列2和序列3所示。本发明专利技术基于该引物组成功建立了采用实时荧光定量PCR技术检测嗜血分枝杆菌的方法，该检测方法具有快速、灵敏度高、特异性强的优点，为嗜血分枝杆菌感染患者的尽早诊断与治疗提供了有效的技术手段。的技术手段。

【技术实现步骤摘要】
一种基于实时荧光定量PCR技术检测嗜血分枝杆菌的方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，具体涉及一种基于实时荧光定量PCR技术检测嗜血分枝杆菌的方法及其应用。

技术介绍

[0002]嗜血分枝杆菌Mycobacterium haemophilum，是一种短杆菌，偶尔略弯曲，或成小绳状，抗酸性强。不为革兰氏染色所染，未见运动性。嗜血分枝杆菌在自然界中普遍存在并且可导致人类的感染，由于此致病菌对培养基的特殊要求(含铁)在体外较难培养，因此在临床诊断中存在诊断难度大的问题。
[0003]分子生物学技术已越来越广泛地应用于致病病原体的检测与鉴定。实时荧光定量PCR技术，是在普通PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。qPCR技术具有准确度高，灵敏，特异性强和检测快速的优点，可以实现从临床标本中直接检测出微量病原菌，因而可以作为临床重要的辅助诊断手段。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是建立一种采用实时荧光定量PCR技术检测嗜血分枝杆菌的方法。
[0005]为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了用于鉴定或辅助鉴定嗜血分枝杆菌的引物组。
[0006]本专利技术提供的用于鉴定或辅助鉴定嗜血分枝杆菌的引物组由引物1、引物2和探针组成；
[0007]所述引物1为如下a1)或a2)：
[0008]a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；
[0009]a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；
[0010]所述引物2为如下a3)或a4)：
[0011]a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；
[0012]a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；
[0013]所述探针为如下a5)或a6)：
[0014]a5)序列表中序列3所示的单链DNA分子；
[0015]a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。
[0016]上述引物组中，所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔比为5:5:4。
[0017]为了解决上述技术问题，本专利技术又提供了上述引物组的新用途。
[0018]本专利技术提供了上述引物组在如下b1)
‑
b8)中任一种中的应用：
[0019]b1)制备鉴定或辅助鉴定待测菌是否为嗜血分枝杆菌的产品；
[0020]b2)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为嗜血分枝杆菌；
[0021]b3)制备诊断或辅助诊断待测者是否感染嗜血分枝杆菌的产品；
[0022]b4)诊断或辅助诊断待测者是否感染嗜血分枝杆菌；
[0023]b5)制备检测或辅助检测待测样品是否含有嗜血分枝杆菌的产品；
[0024]b6)检测或辅助检测待测样品是否含有嗜血分枝杆菌；
[0025]b7)制备鉴别或辅助鉴别嗜血分枝杆菌与其它分枝杆菌的产品；
[0026]b8)鉴别或辅助鉴别嗜血分枝杆菌与其它分枝杆菌。
[0027]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了含有上述引物组的试剂盒；
[0028]所述试剂盒的功能为如下c1)
‑
c4)中任一种：
[0029]c1)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为嗜血分枝杆菌；
[0030]c2)诊断或辅助诊断待测者是否感染嗜血分枝杆菌；
[0031]c3)检测或辅助检测待测样品是否含有嗜血分枝杆菌；
[0032]c4)鉴别或辅助鉴别嗜血分枝杆菌与其它分枝杆菌。
[0033]进一步的，所述试剂盒还可包括用于鉴定嗜血分枝杆菌的其他试剂。在本专利技术中，所述用于鉴定嗜血分枝杆菌的其他试剂可为TaqMan Gene Expression Master Mix。
[0034]更进一步的，所述试剂盒还包括阴性对照(如ddH2O)和阳性对照(如嗜血分枝杆菌标准菌株(29548
TM
)的基因组DNA)。
[0035]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了上述试剂盒的制备方法；所述试剂盒的制备方法为如下d1)或d2)：
[0036]d1)将上述引物组中的各条引物分别单独包装；
[0037]d2)将上述引物组中的各条引物按比例混合在一起。
[0038]进一步的，所述d2)中，所述引物组中的所述引物1、所述引物2和所述探针按照摩尔比为5:5:4的比例混合在一起。
[0039]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测菌是否为嗜血分枝杆菌的方法。
[0040]本专利技术提供的鉴定或辅助鉴定待测菌是否为嗜血分枝杆菌的方法包括如下步骤：提取待测菌的核酸，以待测菌核酸为模板，采用上述引物组进行实时荧光定量PCR；反应结束后通过扩增曲线和CT值判断待测菌是否为嗜血分枝杆菌：若待测菌有S型扩增曲线且CT值＜35，则待测菌为或候选为嗜血分枝杆菌；否则待测菌不为或候选不为嗜血分枝杆菌。
[0041]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种诊断或辅助诊断待测者是否感染嗜血分枝杆菌的方法。
[0042]本专利技术提供的诊断或辅助诊断待测者是否感染嗜血分枝杆菌的方法包括如下步骤：提取待测者的核酸，以待测者核酸为模板，采用上述引物组进行实时荧光定量PCR；反应结束后通过扩增曲线和CT值判断待测者是否感染嗜血分枝杆菌：若待测者有S型扩增曲线且CT值＜35，则待测者感染或候选感染嗜血分枝杆菌；否则待测者未感染或候选未感染嗜血分枝杆菌。
[0043]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种检测或辅助检测待测样品是否含有嗜血分枝杆菌的方法。
[0044]本专利技术提供的检测或辅助检测待测样品是否含有嗜血分枝杆菌的方法包括如下步骤：提取待测样品的核酸，以待测样品核酸为模板，采用上述引物组进行实时荧光定量PCR；反应结束后通过扩增曲线和CT值判断待测样品是否感染嗜血分枝杆菌：若待测样品有S型扩增曲线且CT值＜35，则待测样品含有或候选含有嗜血分枝杆菌；否则待测样品不含有或候选不含有嗜血分枝杆菌。
[0045]为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种鉴别或辅助鉴别嗜血分枝杆菌与其它分枝杆菌的方法。
[0046]本专利技术提供的鉴别或辅助鉴别嗜血分枝杆菌与其它分枝杆菌的方法包括如下步骤：提取待测菌的核酸，以待测菌核酸为模板，采用上述引物组进行实时荧光定量PCR；反应结束后通过扩增曲线和CT值判断待测菌为嗜血分枝杆菌还是其它分枝杆菌：若待测菌有S型扩增曲线且CT值＜35，则待测菌为或候选为嗜血分枝杆菌；否则待测菌为或候选为其它分枝杆菌。
[0047]上述任一所述方法还包括如下步骤：在阴性对照无扩增曲线或CT值＞35且阳性对照有S型扩增曲线且CT值＜35的前提下进行结果判定。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于鉴定或辅助鉴定嗜血分枝杆菌的引物组，由引物1、引物2和探针组成；所述引物1为如下a1)或a2)：a1)序列表中序列1所示的单链DNA分子；a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的单链DNA分子；所述引物2为如下a3)或a4)：a3)序列表中序列2所示的单链DNA分子；a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的单链DNA分子；所述探针为如下a5)或a6)：a5)序列表中序列3所示的单链DNA分子；a6)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于：所述引物1、所述引物2和所述探针的摩尔比为5:5:4。3.权利要求1或2所述的引物组在如下b1)
‑
b8)中任一种中的应用：b1)制备鉴定或辅助鉴定待测菌是否为嗜血分枝杆菌的产品；b2)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为嗜血分枝杆菌；b3)制备诊断或辅助诊断待测者是否感染嗜血分枝杆菌的产品；b4)诊断或辅助诊断待测者是否感染嗜血分枝杆菌；b5)制备检测或辅助检测待测样品是否含有嗜血分枝杆菌的产品；b6)检测或辅助检测待测样品是否含有嗜血分枝杆菌；b7)制备鉴别或辅助鉴别嗜血分枝杆菌与其它分枝杆菌的产品；b8)鉴别或辅助鉴别嗜血分枝杆菌与其它分枝杆菌。4.含有权利要求1或2所述引物组的试剂盒；所述试剂盒的功能为如下c1)
‑
c4)中任一种：c1)鉴定或辅助鉴定待测菌是否为嗜血分枝杆菌；c2)诊断或辅助诊断待测者是否感染嗜血分枝杆菌；c3)检测或辅助检测待测样品是否含有嗜血分枝杆菌；c4)鉴别或辅助鉴别嗜血分枝杆菌与其它分枝杆菌。5.权利要求4所述试剂盒的制备方法，为如下d1)或d2)：d1)将权利要求1或2所述的引物...

【专利技术属性】
技术研发人员：张福仁，刘红，暴芳芳，
申请(专利权)人：山东第一医科大学附属皮肤病医院山东省皮肤病性病防治研究所，山东省皮肤病医院，
类型：发明
国别省市：