一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法技术

本发明专利技术公开了一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法，包括以下步骤：包括引物设计与合成、猫滴虫DNA标准模板CP8

【技术实现步骤摘要】
一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法


[0001]本专利技术涉及病毒检测领域，确切地说是一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法。

技术介绍

[0002]猫滴虫除了寄生胃肠道外，也可寄生在猫的泌尿生殖道中，导致猫子宫积脓，但在已经接受过卵巢子宫切除术或去势术治疗的健康猫中尤其罕见。滴虫体外虫体培养也是一种猫滴虫病敏感性特别强的检测手段，常用的体外商品化培养系统有两种，TF培养系统和改良的Diamond培养基。但由于价格昂贵加之培养技术困难且耗时较长，故不适合大量推广使用。急需建立一种快速、敏感的猫滴虫病检测手段以供临床所需。本研究以重组质粒标准品CP8
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pUCm
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T Vector为模板，通过对一系列反应条件的优化，建立一种猫滴虫SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR诊断方法，有望为临床猫滴虫病的诊断提供一种更快速、更准确的检测手段。
[0003]实时荧光定量PCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。Real
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time PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。SYBR GreenⅠ法就是在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。序列的扩增程度(得率)取决于模板起始量，PCR常用于对样品中的DNA进行定量，其中，最常见的应用是基因表达定量。终点PCR方法虽然可行，但它存在一重大缺点，即需要通过凝胶电泳确定得率，从而限制了检测灵敏度。此外，定量是在PCR末期进行的，而此时的扩增已达到平台期，因此，DNA凝胶染色强度无法与DNA起始量呈线性相关。尽管如此，若在到达平台期之前通过终点PCR对基因表达进行半定量分析，可使用连续稀释的DNA样品作为起始物，或收集指定PCR循环的扩增子，并根据凝胶染色强度估计基因表达量。直到1993年，Higuchi等报道称使用荧光信号对PCR扩增进行实时监测，才克服了终点PCR定量的局限性[8]。这一技术为我们今天所熟知的定量PCR(qPCR)奠定了基础。1997年，第一款qPCR仪进入市场，使PCR能够准确定量基因表达和拷贝数。qPCR依靠对指数期目的片段扩增荧光信号的实时监测，克服了终点PCR定量的缺点。尽管qPCR能够定量检测相对和绝对基因表达，但是其检测能力限制了定量性能。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于针对现有缺陷，提供一种对猫滴虫病的早期诊断和流行病学调查提供了一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法。
[0005]上述目的通过以下方案实现：
[0006]一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法，其特征在于，包括以下步
骤
[0007](1)引物设计与合成
[0008]根据基因序列表所得序列，应用Primer Primer 5.0软件设计一对特异性引物，F2：5'
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ACAAGTTCGCTGCTATGACCC
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3'，R2：5'
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AACAACGCCCTTTTCACGCC
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3'，扩增预期片段大小为137bp，引物经Primer
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BLAST初步验证，后进行合成；
[0009](2)制备猫滴虫DNA标准模板CP8
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pUCm
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T Vector质粒标准品；
[0010](3)荧光定量PCR反应
[0011]反应总体系20μL，其中SYBR GreenⅠMaster荧光染料10μL，10μmol/μL上下游引物各0.4μL，CP8
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pUCm
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T Vector标准品模板2μL，用ddH2O补足至20μL；反应程序为：首先95℃预变性3min，95℃5s，59.3℃30s，65℃5s，共40个循环，最后95℃延伸5min，。
[0012]所述的一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法，其特征在于，所述的猫滴虫DNA标准模板CP8
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pUCm
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T Vector质粒标准品的制备方法为：将经显微镜检查确诊为猫滴虫感染的阳性粪便，严格按照粪便全基因提取试剂盒说明书提取猫球虫总基因组DNA，后用引物F2、R2进行普通PCR扩增，回收目的片段，连接pUCm
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T Vector克隆载体，转化至DH5a大肠杆菌感受态细胞中，涂板、通过含有氨苄抗性的LB固体培养基筛选，挑取单菌落至含有氨苄抗性的LB液体培养基中扩大培养，菌液PCR鉴定后阳性菌液提取重组质粒CP8
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pUCm
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T Vector，进行测序，测序正确的阳性质粒采用酶标仪测定浓度，换算拷贝数，
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18到
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22℃保存备用，即得。
[0013]所述的一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法，其特征在于，所述的猫滴虫DNA标准模板CP8
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pUCm
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T Vector质粒标准品质粒浓度为24ng/μL，换算其拷贝数为2.37
×
10
10
copies/μL。
[0014]本申请的有益效果为：本研究采用SYBR GreenⅠ法建立猫滴虫实时荧光定量PCR诊断方法，通过对荧光定量PCR各反应体系及条件进行了优化，比传统显微镜检测更敏感、迅速，提高了该病的诊断效率。对临床样本进行荧光定量PCR检测，阳性率为85.00％(17/20)，而显微镜检测阳性率为65.00％(10/20)，二者检测的阳性符合率为100％。本实验所建立的荧光定量PCR方法为基层兽医部门对猫滴虫病的早期诊断和流行病学调查提供了一种更为有效可靠的检测办法。
附图说明
[0015]图1为建立荧光定量PCR的标准曲线图；
[0016]图2为特异性试验结果图；
[0017]图中1：猫滴虫2
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5：贾第虫、球虫、冠状病毒、细小病毒6：阴性对照
[0018]1：T.foetus 2
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5：Giardia felis、Isospora felis、Feline coronavirus、Feline parvovirus
[0019]6：ddH2O；
[0020]图3为敏感性试验结果图；
[0021]1‑
10：模板浓度2.37
×
10
10
copies/μL～2.37
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法，其特征在于，包括以下步骤(1)引物设计与合成根据基因序列表所得序列，应用Primer Primer 5.0软件设计一对特异性引物，F2：5'
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ACAAGTTCGCTGCTATGACCC
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3'，R2：5'
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AACAACGCCCTTTTCACGCC
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3'，扩增预期片段大小为137bp，引物经Primer
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BLAST初步验证，后进行合成；(2)制备猫滴虫DNA标准模板CP8
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pUCm
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T Vector质粒标准品；(3)荧光定量PCR反应反应总体系20μL，其中SYBR GreenⅠMaster荧光染料10μL，10μmol/μL上下游引物各0.4μL，CP8
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pUCm
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T Vector标准品模板2μL，用ddH2O补足至20μL；反应程序为：首先95℃预变性3min，95℃5s，59.3℃30s，65℃5s，共40个循环，最后95℃延伸5min。2.根据权利要求1所述的一种基于CP8基因的猫滴虫病的实时荧光PCR诊断方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵洪喜，刘继兵，昝晓庆，丁宝隆，
申请(专利权)人：宁夏大学，
类型：发明
国别省市：