一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法技术

本发明专利技术所示的一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，包括以下步骤：先对蛋白样品还原烷基化使蛋白样品变性，再向已经变性的蛋白样品中加入SP3重悬液及Sera

【技术实现步骤摘要】
一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法


[0001]本专利技术涉及一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，属于生物检测


技术介绍

[0002]蛋白质磷酸化是生物界中最为普遍也是非常重要的一种蛋白质修饰类型，在细胞内，大约有三分之一的蛋白质被认为有磷酸化修饰，蛋白质的磷酸化修饰几乎调节着生命活动的整个过程，包括DNA损伤修复、转录调节、信号转导、细胞凋亡的调节等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可帮助我们阐明上述过程的机理，进一步理解生命系统如何在分子水平进行调控，从而认识生命的本质，在对磷酸化蛋白质或者多肽进行研究前必须先对研究对象进行富集，以提高研究的准确性。因此对蛋白质样品进行磷酸化富集是必经之路。
[0003]由于磷酸化多肽富集需要10
‑
15mg蛋白酶解产物，现有技术常常采用多次酶解的方法进行，但是酶解效率低，副产物较多，不利于磷酸化多肽富集步骤的展开，导致了磷酸化多肽富集效率的低下。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，可以促进蛋白质快速酶解，提升磷酸化多肽的富集效率，有利于磷酸化富集的大规模进行。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0005]一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，包括以下步骤：先对蛋白样品还原烷基化使蛋白样品变性，再向已经变性的蛋白样品中加入SP3重悬液及Sera
‑
Mag Beads以便于分离和富集，然后进行酶解得到多肽，最后通过富集柱富集磷酸化多肽。
[0006]进一步地，包括以下详细步骤：
[0007]S1、使蛋白样品变性：取蛋白样品，先加入1M二硫苏糖醇溶液，得到蛋白样品浓度为10mM的溶液，混匀后在37℃孵育60
‑
90min，再加入1M碘乙酰胺溶液，得到蛋白样品浓度为25mM的溶液，混匀后室温避光反应20
‑
40min，再次加入1M二硫苏糖醇溶液，得到蛋白样品浓度为10mM的溶液，室温下反应5
‑
15min；
[0008]S2、加入SP3重悬液及Sera
‑
Mag Beads：取S1反应后的溶液，先加入SP3重悬液，且加入所述SP3重悬液的体积不少于溶液的体积，混匀，再按照蛋白样品：Sera
‑
Mag Beads＝1:10的质量比例加入Sera
‑
Mag Beads，得到溶液a，然后加入与所述溶液a等体积的无水乙醇，用移液枪吹打混匀，放入恒温混匀仪，转速800
‑
1000rpm，在室温25℃下，混匀5
‑
15min，降速离心后将得到的沉淀物a用乙醇进行清洗操作；
[0009]S3、酶解：取S2清洗后的沉淀物a，先加入25mM NH4HCO3溶液，得到样品浓度为1mM的溶液，再按蛋白样品：胰蛋白酶＝1:50的质量比例添加胰蛋白酶，用恒温混匀仪800
‑
1000rpm混匀，37℃消化过夜，然后使用16000
‑
18000g离心5
‑
10min，置于磁力架上，完全吸附后取上清液a，将所述上清液a冷冻干燥，得到干燥品a；
[0010]S4、将S3得到的干燥品a加入200ul的洗脱液，涡旋混匀，使多肽重悬；
[0011]S5、通过富集柱富集磷酸化多肽：先平衡富集柱，然后取S4已重悬的溶液200ul加入到富集柱中，拧紧盖子；轻微振荡富集柱底部5
‑
15s，混匀，室温孵育20
‑
50min，多次重复振荡
‑
混匀的操作；然后使用900
‑
1200g离心20
‑
40s，除去经富集柱流下来的液体，得到沉淀物b；
[0012]S6、对S5得到的沉淀物b进行洗涤，更换新的收集管，加入100ul的洗脱液，使用900
‑
1200g离心20
‑
40s，再次加入100ul的洗脱液，且使用900
‑
1200g离心20
‑
40s，收集离心后的洗脱液，合并洗脱液并进行冷冻干燥，得到干燥品b，即完成磷酸化多肽的收集；
[0013]S7、将S6得到的干燥品b用含0.1％FA的溶液溶解，高速离心取上清液b，取1ug所述上清液b用LC
‑
MS进行质谱分析，以检测富集后的磷酸化多肽。
[0014]进一步地，步骤S2中所述SP3重悬液的组成为50mM 4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸，1％十二烷基硫酸钠，1％聚乙二醇辛基苯基醚，1％吐温20，1％乙基苯基聚乙二醇，5mM乙二胺四乙酸，50mM氯化钠，1％的丙三醇，1
×
蛋白酶抑制剂和5mM二硫苏糖醇。
[0015]进一步地，步骤S2中清洗的详细步骤为：加入180ul 80％乙醇，用移液枪吹打混匀，再放入磁力架吸附，重复2
‑
4次。
[0016]进一步地，步骤S2中Sera
‑
Mag Beads为两种Beads的等体积混合物，两种Beads分别为Sera
‑
Mag magnetic carboxylate和Sera
‑
Mag Speed Beads carboxylate。
[0017]进一步地，步骤S4中还包括检测已重悬溶液的PH值，若PH＞3，则加入适量100％TFA溶液，调节PH值至PH＜3。
[0018]进一步地，步骤S5中所述平衡富集柱的详细步骤为：先去除柱体底部密封部位，拧松顶部盖子，然后将柱体置于涡旋仪自带的2ml收集管中，使用900
‑
1200g离心20
‑
40s，以去除储液；再加入200ul洗脱液，使用900
‑
1200g离心20
‑
40s，去除柱内液体，并多次重复清洗操作；最后拧紧顶部盖子，底部套紧白色玻璃棉，置于新的离心管中。
[0019]进一步地，步骤S5中所述平衡富集柱的清洗操作重复次数是1
‑
3次。
[0020]进一步地，步骤S5中所述的振荡
‑
混匀操作的重复频率为每10min重复一次。
[0021]进一步地，步骤S6中所述洗涤的详细步骤为：先加入200ul洗脱液，使用900
‑
1200g离心20
‑
40s，去除洗脱液，重复3
‑
5次，最后加入200ul水，使用900
‑
1200g离心20
‑
40s，去除水。
[0022]本专利技术的有益效果在于：本专利技术采用Single
‑
pot，Solid
‑
phase
‑
enhanced Sample
‑
preparation(简写为SP3)重悬液与Sera
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：先对蛋白样品还原烷基化使蛋白样品变性，再向已经变性的蛋白样品中加入SP3重悬液及Sera
‑
Mag Beads以便于分离和富集，然后进行酶解得到多肽，最后通过富集柱富集磷酸化多肽。2.如权利要求1所述的一种快速酶解及富集磷酸化多肽的方法，其特征在于，包括以下详细步骤：S1、使蛋白样品变性：取蛋白样品，先加入1M二硫苏糖醇溶液，得到蛋白样品浓度为10mM的溶液，混匀后在37℃孵育60
‑
90min，再加入1M碘乙酰胺溶液，得到蛋白样品浓度为25mM的溶液，混匀后室温避光反应20
‑
40min，再次加入1M二硫苏糖醇溶液，得到蛋白样品浓度为10mM的溶液，室温下反应5
‑
15min；S2、加入SP3重悬液及Sera
‑
Mag Beads：取S1反应后的溶液，先加入SP3重悬液，且加入所述SP3重悬液的体积不少于溶液的体积，混匀，再按照蛋白样品：Sera
‑
Mag Beads＝1:10的质量比例加入Sera
‑
Mag Beads，得到溶液a，然后加入与所述溶液a等体积的无水乙醇，用移液枪吹打混匀，放入恒温混匀仪，转速800
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1000rpm，在室温25℃下，混匀5
‑
15min，降速离心后将得到的沉淀物a用乙醇进行清洗操作；S3、酶解：取S2清洗后的沉淀物a，先加入25mM NH4HCO3溶液，得到样品浓度为1mM的溶液，再按蛋白样品：胰蛋白酶＝1:50的质量比例添加胰蛋白酶，用恒温混匀仪800
‑
1000rpm混匀，37℃消化过夜，然后使用16000
‑
18000g离心5
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10min，置于磁力架上，完全吸附后取上清液a，将所述上清液a冷冻干燥，得到干燥品a；S4、将S3得到的干燥品a加入200ul的洗脱液，涡旋混匀，使多肽重悬；S5、通过富集柱富集磷酸化多肽：先平衡富集柱，然后取S4已重悬的溶液200ul加入到富集柱中，拧紧盖子；轻微振荡富集柱底部5
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15s，混匀，室温孵育20
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50min，多次重复振荡
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混匀的操作；然后使用900
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1200g离心20
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40s，除去经富集柱流下来的液体，得到沉淀物b；S6、对S5得到的沉淀物b进行洗涤，更换新的收集管，加入100ul的洗脱液，使用900
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1200g离心20
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40s，再次加入100ul的洗脱液，且使用900
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1200g离心20
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40s，收集离心后的洗脱液，合并洗脱液并进行...

【专利技术属性】
技术研发人员：张益，曹轩铭，
申请(专利权)人：江苏艾苏莱生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：