一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用，属于生物医学技术领域；所述重组胰腺癌细胞包含重组载体；所述重组载体上插入有目的基因pHluorin_M153R

【技术实现步骤摘要】
一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，具体涉及一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用。

技术介绍

[0002]外泌体是一类大小为30～150nm、呈茶托状的由脂质双层膜包裹的细胞外囊泡，广泛存在于细胞培养上清及各种体液中，包括血液、淋巴液、唾液、尿液、卵泡液、精液、心包液、乳汁等。外泌体起源于细胞内体，细胞质膜的连续内陷最终导致多囊泡体的形成，多囊泡体与细胞内的其他囊泡和细胞器相互作用，导致外泌体的最终形成，并促进外泌体成分的多样性。细胞成分通过外泌体进行细胞间的交流与运输，肿瘤细胞分泌的外泌体可以通过塑造肿瘤微环境来帮助其转移，其分泌数量可直接影响到肿瘤的转移，也在促进肿瘤形成和增殖的过程中发挥十分重要的作用。据报道，外泌体存在于所有生物体液中，通过生物体液取样可以很容易地获得外泌体复合物的组成，基于生物液体活检可显示出外泌体在诊断肿瘤和其他疾病以及揭示其预后的方面有着重大潜力能。而外泌体具体致病行为机制的研究难以突破，多受限于其行为过程的可视化呈现。
[0003]胰腺癌是消化道常见恶性肿瘤之一，在肿瘤领域素有“癌症之王”的称号。胰腺癌具有外泌体明显分泌增强的特点，研究胰腺癌疾病深层机制的一大难题就是对外泌体行为的观察、测量及可视化。
[0004]体内追踪外泌体可以提供有关外泌体的生物分布、迁移能力、毒性、生物学的重要知识角色，沟通能力和行动机制。现有技术中，研究人员使用分子生物学方法将荧光蛋白(例如绿色荧光蛋白GFP；红色荧光蛋白RFP)与外泌体膜上的标记蛋白如CD63、CD9、CD81等融合表达可以跟踪外泌体从供体到受体细胞的运动。通过监测膜蛋白的荧光，可以实现活体培养物中和体内外泌体转移的直接可视化。例如，将外泌体的特定蛋白CD63和绿色荧光蛋白GFP的表达元件构建成质粒再包装到慢病毒中，随后用此慢病毒感染细胞，使细胞分泌的外泌体带有绿色荧光。但是，常规的GFP
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CD63的外泌体示踪方法中，荧光不稳定且不够明亮，难以对动态的外泌体释放及摄取实行可视化。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞及其应用，基于本专利技术重组胰腺癌细胞进行的外泌体示踪方法，荧光稳定且明亮，能够对动态的外泌体释放及摄取实行可视化。
[0006]本专利技术提供了一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞，所述重组胰腺癌细胞包含重组载体；所述重组载体上插入有目的基因pHluorin_M153R
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CD63；所述目的基因pHluorin_M153R
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CD63为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因。
[0007]优选的，所述重组载体的原始载体包括pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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PURO。
[0008]优选的，所述pHluorin_M153R
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CD63在pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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PURO上的插入位点的5
’
端的限制性酶切位点为EcoR I，3
’
端的限制性酶切位点为NotI。
[0009]本专利技术还提供了上述方案所述的重组胰腺癌细胞在制备用于胰腺癌细胞外泌体示踪的试剂或试剂盒中的应用。
[0010]本专利技术还提供了一种胰腺癌细胞外泌体示踪的方法，包括以下步骤：
[0011]使用荧光显微镜对上述方案所述的重组胰腺癌细胞进行镜下观察。
[0012]优选的，所述镜下观察包括活细胞观察和/或细胞免疫荧光观察。
[0013]优选的，所述观察的内容包括如下项目中的一种或几种：
[0014](1)观察细胞外外泌体的阳性荧光标记；
[0015](2)观察细胞外外泌体的寻径轨迹；
[0016](3)观察多囊泡体与细胞质膜的融合情况。
[0017]本专利技术提供了一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞，所述重组胰腺癌细胞包含重组载体；所述重组载体上插入有目的基因pHluorin_M153R
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CD63；所述目的基因pHluorin_M153R
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CD63为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因。本专利技术通过对CD63
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GFP融合蛋白的编码基因进行改造，添加pH敏感的GFP衍生物pHluorin来降低CD63
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GFP融合蛋白在细胞内体中的过高亮度，以更好地观察多囊泡体(MVB)与质膜的动态融合事件，并加入单一氨基酸突变M153R使得pHluorin
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CD63在细胞2D及3D培养条件下不易漂白和淬灭。本专利技术基于插入有目的基因pHluorin_M153R
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CD63的重组载体进行胰腺癌稳定细胞系的构建，转染重组质粒后的重组胰腺癌稳定细胞系进行显微镜下的活细胞观察或细胞免疫荧光观察，共聚焦显微镜下对细胞外的外泌体及其释放于细胞外基质中的尾部斑点进行有效标记，可更容易地观察其寻径轨迹，从而揭示迁移活细胞的致病行为。本专利技术解决了外泌体致病行为机制研究中的可视化难题，构建得到了明亮、稳定、且适用于多种细胞培养环境的荧光示踪物质，可监测活细胞在迁移过程中外泌体的释放和摄取量，以及寻径轨迹的观察，用于外泌体在疾病的致病机制的研究。
附图说明
[0018]图1为实施例1的荧光成像结果；
[0019]图2为WesternBlot效率验证结果；
[0020]图3为比较例的荧光成像结果。
具体实施方式
[0021]本专利技术提供了一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞，所述重组胰腺癌细胞包含重组载体；所述重组载体上插入有目的基因pHluorin_M153R
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CD63；所述目的基因pHluorin_M153R
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CD63为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因。
[0022]本专利技术通过对CD63
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GFP融合蛋白的编码基因进行改造，添加pH敏感的GFP衍生物pHluorin来降低CD63
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GFP融合蛋白在细胞内体中的过高亮度，以更好地观察多囊泡体(MVB)与质膜的动态融合事件，并加入单一氨基酸突变M153R使得pHluorin
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CD63在细胞2D及3D培养条件下稳定表达，避免荧光的过早漂白和淬灭。
[0023]在本专利技术中，所述目的基因pHluorin_M153R
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CD63为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因；SEQ ID NO.1所示的蛋白的氨基酸序列具体为：
[0024]SKGEELFTGVVPILVELDGDVNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可用于外泌体示踪的重组胰腺癌细胞，所述重组胰腺癌细胞包含重组载体；所述重组载体上插入有目的基因pHluorin_M153R
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CD63；所述目的基因pHluorin_M153R
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CD63为氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的蛋白的编码基因。2.根据权利要求1所述的重组胰腺癌细胞，其特征在于，所述重组载体的原始载体包括pCDH
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CMV
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MCS
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EF1
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PURO。3.根据权利要求2所述的重组胰腺癌细胞，其特征在于，所述目的基因pHluorin_M153R
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CD63在pCDH
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CMV
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M...

【专利技术属性】
技术研发人员：肖明兵，吴桐，陈飞，林仁杰，季洁，马彭，崔小鹏，钱坤艳，徐伟松，
申请(专利权)人：南通大学附属医院，
类型：发明
国别省市：