血红蛋白分析方法技术

本发明专利技术提供一种能够将HbA0组分高精度地分离的血红蛋白分析方法。一种血红蛋白分析方法，该方法包括通过使用了以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液的离子交换色谱来洗脱包含血红蛋白A0的组分，该缓冲剂是磷酸盐或者两性离子缓冲剂，该洗脱液的pH在该缓冲剂的pKa的

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】血红蛋白分析方法


[0001]本专利技术涉及一种血红蛋白的分析方法。

技术介绍

[0002]在有机化学、生物化学、医学等领域中，样本中的成分的分析通常使用液相色谱。例如，在医学的领域中，血红蛋白(Hb)的分析利用液相色谱。正常人Hb的大部分为HbA，并且HbA主要包含HbA0和糖化的HbA1c。HbA1c是血中的糖与血红蛋白结合而成的糖化血红蛋白，用作糖尿病等的标志物。血中HbA1c浓度(％)、即血中全部Hb中的HbA1c的比例反映出过去1～2个月的血糖值的平均值，广泛用作糖尿病诊断的指标。
[0003]专利文献1和2中记载了通过阳离子交换色谱将HbA1c组分和HbA0组分分离的方法，该方法包括依次使用下述洗脱液A和洗脱液B，且将测定体系中产生的压力值设为9.8
×
103Pa～19.6
×
105Pa：
[0004]洗脱液A：pH为4.0～6.0，并且包含如下的成分的洗脱液：(1)离液离子、(2)在3.5以上且小于6.5的范围具有酸解离常数且选自一元羧酸、二元羧酸、三元羧酸以及氨基酸中的至少一种酸或其盐，以及(3)在6.5～9.5的范围具有酸解离常数且为无机含氧酸和氨基酸中的至少任一种的酸或者其盐，
[0005]洗脱液B：pH与洗脱液A相比高0.5～3.0，并且浓度与洗脱液A相比小20～200mmol/L或者pH为7.0～10.0的洗脱液。
[0006]专利文献3中记载了通过使用了pH8.1以上、渗透压40mOsm/kg以下的洗脱液的阳离子交换色谱，从血液试样中分离出包含异常血红蛋白和地中海贫血标志物的各种血红蛋白的方法。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1：日本特开2014－095637号公报
[0010]专利文献2：日本特开2014－095638号公报
[0011]专利文献3：国际公开公报第2019/203302号

技术实现思路

[0012]为了正确算出血红蛋白(Hb)A1c浓度，要求在液相色谱分析中将HbA1c和其它的Hb类、特别是HbA0分别高精度地分离。如果HbA0的分离精度降低，则不仅无法正确地计算HbA1c浓度，而且无法检测在HbA0的附近具有峰的HbA2、HbS、HbC等(这些作为表示Hb的形成异常的指标使用)。
[0013]然而，实际的色谱分析中，即使在使用相同的样本的相同测定条件下，也存在HbA0的洗脱时间、分离能力不同的情况。根据本专利技术人的研究推测该洗脱时间、分离能力的偏差是因色谱分析装置的构造上(例如部件尺寸、组装)的偏差、以及由动作的略微不同导致的洗脱液的送液条件的变动所产生的。本专利技术提供一种血红蛋白分析方法，该方法不受分析
装置的构造上的偏差、以及由动作的不同带来的影响，能够高精度地将HbA0组分分离。
[0014]因此，本专利技术提供以下的技术方案。
[0015]〔1〕一种血红蛋白分析方法，该方法包括通过使用了以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液的离子交换色谱来洗脱包含血红蛋白A0的组分，
[0016]该缓冲剂为两性离子缓冲剂，
[0017]该洗脱液的pH在该缓冲剂的pKa的
±
0.1以内。
[0018]〔2〕根据〔1〕所述的方法，其中，所述两性离子缓冲剂为TES。
[0019]〔3〕根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述洗脱液的渗透压为60mOsm/kg以下。
[0020]〔4〕根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，进一步包括在洗脱上述包含血红蛋白A0的组分之前使用洗脱液A洗脱包含血红蛋白A1c的组分，该洗脱液A为pH4.0～6.8的缓冲液。
[0021]〔5〕根据〔4〕所述的方法，其中，上述洗脱液A与上述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液之间的替换是通过阶式梯度进行的。
[0022]〔6〕根据〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，进一步包括在上述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液之后，通入洗脱液B，该洗脱液B为pH6.0～10.0的缓冲液。
[0023]〔7〕根据〔6〕所述的方法，其中，上述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液与上述洗脱液B的替换是通过阶式梯度进行的。
[0024]〔8〕根据〔1〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，上述离子交换色谱为阳离子交换色谱。
[0025]〔9〕根据〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，上述色谱为高效液相色谱。
[0026]〔10〕一种离子交换色谱的血红蛋白A0分离用洗脱液，其中，以小于25mM的浓度含有缓冲剂，具有该缓冲剂的pKa的
±
0.1以内的pH，该缓冲剂为两性离子缓冲剂。
[0027]〔11〕根据〔10〕所述的洗脱液，其中，上述两性离子缓冲剂为TES。
[0028]〔12〕根据〔10〕或〔11〕所述的洗脱液，其中，渗透压为60mOsm/kg以下。
[0029]〔13〕根据〔10〕～〔12〕中任一项所述的洗脱液，其中，在离子交换色谱中，在洗脱液A之后使用，该洗脱液A为pH4.0～6.8的缓冲液。
[0030]〔14〕根据〔10〕～〔13〕中任一项所述的洗脱液，其中，在离子交换色谱中，在洗脱液B之前使用，该洗脱液B为pH6.0～10.0的缓冲液。
[0031]根据本专利技术，可以在不受分析装置的构造上的偏差、以及因动作的不同带来的影响的情况下，从试样中高精度地分离HbA0。本专利技术对各种血红蛋白种类的高灵敏度的检测和HbA1c浓度的正确的测定有用。
附图说明
[0032]图1是利用使用了各种洗脱液C的HPLC进行的HbA0分离。各图表示2台HPLC装置(装置A、B)中得到的色谱的整体图像(上)和A0峰的放大图像(下)。各图上的数值表示洗脱液C的TES浓度和pH。
[0033]图2是图1的后续。
具体实施方式
[0034]本专利技术涉及一种利用离子交换色谱进行的血红蛋白分析方法。作为用于本专利技术的血红蛋白分析方法(以下，也称为本专利技术的方法)的试样，可以使用通常的血红蛋白分析中使用的、包含血红蛋白的血液试样。例如，可以使用将从人体采取的血液进行溶血或稀释而得的血液试样。
[0035]优选地，利用本专利技术的方法进行的色谱为液相色谱，更优选为高效液相色谱(HPLC)。本专利技术的离子交换色谱可以使用与公知的液相色谱系统、即具备洗脱液送液用的泵、采样器、检测器等的系统连接的离子交换柱等进行。
[0036]优选地，本专利技术的方法中进行的离子交换色谱是使用了具有阳离子交换基团的固定相的阳离子交换色谱。优选地，填充有该具有阳离子交换基团的固定相的阳离子交换柱用于该阳离子交换色谱。作为该阳离子交换基团，可举出羧基、磷酸基、磺酸基等，其中优选为磺酸基。
[0037]作为该固定相，可举出填充剂粒子、多孔质体等，优选为填充剂粒子。作为该填充剂粒子，可举出无机系粒子、有机系粒子等。作为该无机本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种血红蛋白分析方法，该方法包括通过使用了以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液的离子交换色谱来洗脱包含血红蛋白A0的组分，该缓冲剂为两性离子缓冲剂，该洗脱液的pH在该缓冲剂的pKa的
±
0.1以内。2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述两性离子缓冲剂为TES。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述洗脱液的渗透压为60mOsm/kg以下。4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，进一步包括在洗脱所述包含血红蛋白A0的组分之前使用洗脱液A洗脱包含血红蛋白A1c的组分，该洗脱液A为pH4.0～6.8的缓冲液。5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述洗脱液A与所述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液之间的替换是通过阶式梯度进行的。6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，进一步包括在所述以小于25mM的浓度含有缓冲剂的洗脱液之后，通入洗脱液B，该洗脱液B为pH6.0～10.0的缓冲液。7.根据权利要求6所述的方法...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅津美奈，根本有理子，太平博晓，
申请(专利权)人：积水医疗株式会社，
类型：发明
国别省市：