可拉酸发酵放大工艺制造技术

本发明专利技术公开了可拉酸发酵放大工艺，该工艺包括以下步骤：将LBG培养基加入发酵罐中，全程控制pH值5.2，发酵培养第0

【技术实现步骤摘要】
可拉酸发酵放大工艺


[0001]本专利技术涉及可拉酸发酵放大工艺。

技术介绍

[0002]可拉酸(Colanic acid，CA)是一种细菌胞外多糖，由大多数大肠杆菌菌株以及肠杆菌科的其他物种产生，是菌体在生命活动过程中为了适应环境的变化、提高自身生存几率而合成的多糖。CA分子量较大，松散地包裹在菌体表面，使得菌体显示粘液状态，防止细胞失水、保护细胞同时抵御有害物质。在不利于生长的环境条件下，例如干燥、低压及低pH值下，粘液化菌株比野生菌株具有更强的生存力。
[0003]CA作为一种独特的活性生物聚合物，具有特殊的生物学特性和生理参数，具有广泛的应用前景。例如，CA由于其多孔的纤维素结构和位于胶体表面的大量亲水基团，是一种天然的水凝胶，具有优异的补水能力和柔软的质地，是未来化妆品和医疗保健市场的良好候选产品。
[0004]在以斑马鱼为模型的体内研究中发现，含有岩藻糖的多糖或寡糖具有明显的抗炎功能。另有研究表明，岩藻糖分子或者含有岩藻糖的多糖或寡糖可以更加容易渗入真皮中，增加皮肤厚度以及促进胶原结构更加细密化，因此岩藻糖及富含岩藻糖的多糖或寡糖可以减缓皮肤衰老。而CA是由D
‑
葡萄糖、L
‑
岩藻糖、D
‑
半乳糖、D
‑
葡萄糖醛酸以及侧链上非化学计量修饰的O
‑
乙酰和丙酮酸组成，其中L
‑
岩藻糖含量高达约30％，这意味着CA在抗炎、增强免疫力及抗衰老等方面将具有巨大的应用潜力。
[0005]因此获取大量该多糖原料是未来进一步进行有效研究的基础。而至今没有见到该多糖规模化发酵的先例。

技术实现思路

[0006]本申请的目的在于提供可拉酸发酵放大工艺，实现了可拉酸在大容量发酵罐中的放大发酵培养，可拉酸浓度达到15.8g/L。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0008]可拉酸100
‑
500L发酵罐发酵放大工艺，包括以下步骤：
[0009]将LBG培养基或改良LBG培养基加入发酵罐中，全程控制pH值5.2，接种量5％，温度为37℃；发酵培养第0
‑
4h，培养基溶氧控制在15
‑
25％，通气量为2vvm，通过转速与溶氧偶联控制；发酵培养第4
‑
12h，培养基溶氧控制在5
‑
10％，通气量为2vvm，通过转速与溶氧偶联控制；发酵培养第12
‑
24h，溶氧控制在25
‑
35％，通气量调整至3
‑
4vvm；经过24h发酵后，发酵液中含有高浓度的可拉酸；
[0010]所述发酵罐的规格优选300L；
[0011]所述改良LBG培养基的组成是(g/L)：酵母粉5
‑
10，蛋白胨15，NaCl 10，葡萄糖20；所述酵母粉的用量优选10；
[0012]所述的培养基，其加入量占发酵罐体积的30％
‑
70％；
[0013]所述的接种量，接种的是含有高产可拉酸的工程菌的种子液或发酵液；
[0014]所述种子液的OD
600
值为2
‑
4；
[0015]所述的工程菌是以BL21、MG1655、W3110菌株中的任何一株为出发菌株，但不局限于所述的上述菌株，采用CRISPR/Cas9技术敲除核心糖合成模块相关基因簇waaL
‑
waaQ，具体包括以下步骤：
[0016](1)敲除框的构建：以出发菌株基因组为模板，用引物LQ
‑
arm1
‑
F/R、LQ
‑
arm2
‑
F/R扩增waaL
‑
waaQ基因簇上下游同源臂LQ
‑
arm1和LQ
‑
arm2，通过融合PCR，获得重组同源臂片段LQ
‑
arm；
[0017](2)含sgRNA质粒的构建：合成引物LQ
‑
N20
‑
F/R，以pTarget质粒为模板，全质粒PCR；环化PCR产物直接加入快切酶DpnI消化(37℃，1h)、柱回收；回收产物取5ul转化进DH5
ɑ
感受态，37℃培养，涂布Spc板，挑取阳性菌落提取pTarget
‑
LQ质粒；
[0018](3)敲除步骤：将LQ
‑
arm片段和pTarget
‑
LQ质粒转入出发菌株中，得到工程菌ΔLQ；
[0019]所述基因簇waaL
‑
waaQ与细胞脂多糖的合成直接相关，该基因簇的敲除会显著改变菌株的生长性状和特征；同时基因簇waaL
‑
waaQ合成细胞脂多糖所需的前体物质与CA合成所需前体物质有相同的成分。
[0020]所述的工程菌ΔLQ由于敲除了基因簇waaL
‑
waaQ，抑制了基因簇waaL
‑
waaQ与CA合成相互竞争前体能量物质，改变了菌株代谢流流向CA合成的路径，从而提高了物质利用率及CA产率。
[0021]所述的发酵液，沸水煮10
‑
15min灭活工程菌，静置至室温；加水稀释、离心(10000g离心30min)、取上清液，重复该操作直至上清液澄清，确保工程菌去除干净；上清液透析至少48h，适度浓缩后，加入无水乙醇静置至少12h，离心(10000g离心30min)去上清，所得沉淀以无水乙醇洗涤若干次，沉淀自然晾干后，加去离子水打匀，加入无水乙醇醇沉若干次，得到纯化后的可拉酸。
[0022]本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：
[0023]本申请根据可拉酸工程菌的结构特点，对其层级放大(摇瓶、10L发酵罐、100
‑
500L发酵罐)发酵过程中的系列参数做了优化。同时发现，在CA的不同规模发酵过程中，对溶氧量的需求规律是不同的；尤其在100
‑
500L发酵罐中，溶氧量并非越高越好。本申请对上述过程中的相关参数做了改进和优化，实现了可拉酸在大容量发酵罐中的放大发酵培养，可拉酸浓度达到15.8g/L。
附图说明
[0024]图1是不同pH值下可拉酸产量。
[0025]图2是不同温度下可拉酸产量。
[0026]图3是不同接种量下可拉酸产量。
[0027]图4是不同装液量下可拉酸产量。
[0028]图5是不同培养基下可拉酸产量。
[0029]图6是实施例7中可拉酸产量。
[0030]图7是实施例8中可拉酸产量。
[0031]图8是实施例9中可拉酸产量。
[0032]图9是不同溶氧方案下可拉酸产量。
具体实施方式
[0033]下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限于此。本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.可拉酸100
‑
500L发酵罐发酵放大工艺，其特征在于包括以下步骤：将LBG培养基或改良LBG培养基加入发酵罐中，全程控制pH值5.2，接种量5％，温度为37℃；发酵培养第0
‑
4h，培养基溶氧控制在15
‑
25％，通气量为2vvm，通过转速与溶氧偶联控制；发酵培养第4
‑
12h，培养基溶氧控制在5
‑
10％，通气量为2vvm，通过转速与溶氧偶联控制；发酵培养第12
‑
24h，溶氧控制在25
‑
35％，通气量调整至3
‑
4vvm；经过24h发酵后，发酵液中含有高浓度的可拉酸；所述的接种量，接种的是含有高产可拉酸的工程菌的种子液或发酵液；所述的工程菌是以BL21、MG1655、W3110菌株中的任何一株为出发菌株，采用CRISPR/Cas9技术敲除核心糖合成模块相关基因簇waaL
‑
waaQ。2.根据权利要求1所述的发酵放大工艺，其特征在于：所述的工程菌由以下步骤制得：(1)敲除框的构建：以出发菌株基因组为模板，用引物LQ
‑
arm1
‑
F/R、LQ
‑
arm2
‑
F/R扩增waaL
‑
waaQ基因簇上下游同源臂LQ
‑
arm1和LQ
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arm2，通过融合PCR，获得重组同源臂片段LQ
‑
arm；(2)含sgRNA质粒的构建：合成引物LQ
‑
N...

【专利技术属性】
技术研发人员：金学荣，何世琪，李佳明，陈智荣，赵裕栋，崔俊锋，钟超，
申请(专利权)人：深圳柏垠生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：