酶分子机器技术制备无支链的直链甘露聚糖的方法及应用技术

发明专利技术公开了一种酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链甘露聚糖的方法及应用，它是应用现代声化技术辅助酶解——β

【技术实现步骤摘要】
酶分子机器技术制备无支链的直链甘露聚糖的方法及应用


[0001]本专利技术属于现代化工技术和酶分子机器技术集成的生物医药领域，更确切说是应用超声波空化传质辅助，酶分子机器技术和膜分离分级技术制备出无支链的直链甘露聚糖,形成一类新化合物集群及应用。

技术介绍

[0002]据文献报道，至今已有近100种植物的多糖被分离提取出来(Franz G,et al，2007)。由于植物多糖来源广泛且生物相容性好，应用于生物体毒副作用小，因此对植物多糖的研究已成为生物界的热门领域(申利红等,2011.8)。
[0003]在植物多糖中，单体化学成份占比很大的品种有魔芋胶(葡甘聚糖占70％以上)和瓜尔豆胶(半乳甘露聚糖占80％以上)，非常具有产业化开发的原料潜能，其中尤以瓜尔豆胶为最。
[0004]以往的一些文献中常有研究人员把葡甘聚糖也称为甘露聚糖(李宏涛，2004.5，<氨基甘露聚糖的制备、理化性质及应用的研究>，该文献就把“氨基葡甘聚糖”变称为氨基甘露聚糖，且在文献开篇的“符号说明”中明确定义“aminoglucomannan”为氨基甘露聚糖，而实际上该英文全称所对应的正确中文全称应是氨基葡甘聚糖)。我们知道，葡甘聚糖和甘露聚糖分子结构的主要差异在于，葡甘聚糖主链上是由葡萄糖和甘露糖按1.6：1组成的杂多糖，而甘露聚糖主链上由甘露糖组成的同多糖，这一点很容易让人搞混淆。
[0005]瓜尔豆胶中的半乳甘露聚糖的分子结构较特殊(蒋建新等，2001.7)，在甘露聚糖主链上按2：1带有半乳糖支链，这种结构既使其产生了增稠功能，但也阻碍了甘露聚糖螺旋结构的形成，进而会限制其药学功能。
[0006]2009年以来，王玲玲等，2009.3月报道了使用纤维素酶和普鲁蓝酶降低相对低分子质量胡芦巴半乳甘露聚糖的方法，菅红磊2009.4，报道了使用α
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半乳糖苷酶对半乳甘露聚糖进行酶法改性的研究综述，董墨思2016.9，报道了部分酶解瓜尔豆胶功能性的研究进展，雷鹏等2018.7，用瓜尔胶部分去分支，与黄原胶复配增稠，申请了专利：CN108835611A，高冬梅等，2015.9，超声波在有机合成中的应用综述。
[0007]前面说到的声化作用，主要是指超声波作用于化学反应，特别是有机合成与分解。超声波的声化作用主要是利用超声的空化现象，空化泡崩溃产生局部的高温、高压和强烈的冲击波及射流，为一般条件下难以实现或不可能实现的化学反应提供了一种新的非常特殊的物理化学环境，它是一门新兴的声学与化学边缘交叉学科，在有机精细合成和分解反应中大有可为。
[0008]上述对半乳甘露聚糖进行酶法改性研究的目的主要是为了把半乳甘露聚糖降解为低聚半乳甘露聚糖，其局限性显而易见。一是低聚半乳甘露聚糖的生理功能仅限于调理人体肠胃；二是改性后的半乳甘露聚糖用作食品和化工增稠剂；三是生物药通常都是大分子物质，业界普遍认为，20kDa以上的分子量才具有药学功能的潜质，因其要与人体内的大分子病变物质相适配；四是这些研究都还处于实验室规模的小型实验，技术不成熟；生物科
技人员毕生有两大任务：发现问题和解决问题，而问题正是研究工作的起点。

技术实现思路

[0009]本申请专利技术人运用超声波的声化技术，辅助酶法对半乳甘露聚糖脱除半乳糖支链进行中试规模的改性，令其转化为无支链直链甘露聚糖，再运用膜分离分级技术筛分出不同分子量(段)直链甘露聚糖，为缔造创新药苗头物或先导物解决技术难题，奠定技术基础。
[0010]半乳甘露聚糖属植物多糖类化合物,其分子量(Mn)因来源不同而异,大约30kDa左右。其结构是由D
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甘露糖通过β
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1,4糖苷键连接形成主链,在甘露糖主链的C
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6位上以1,6 糖苷键连接支链D
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半乳糖，甘露糖与半乳糖之比值也因植物品种不同而有差异：槐豆胶为4：1，胡芦巴胶为1.2：1，皂荚胶为2.5：1，瓜尔豆胶为2：1，其分支度虽然较高，但因原料来源量大，而且含糖量高，所以值得研究应用。半乳甘露聚糖的分子结构见下。
[0011][0012]注：半乳甘露聚糖(galactomannans,Gm)，甘露聚糖(mannans)；
[0013]半乳糖(galactose,Gal)
[0014]基于上述分析，本专利技术所解决的技术问题是应用超声波的声化技术，辅助酶分子机器技术制备无支链不同分子量(段)直链甘露聚糖的方法及应用，它是应用超声波的声化技术、β
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甘露聚糖酶，普鲁蓝酶和α
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半乳糖苷酶，共同构成制备无支链的直链甘露聚糖的酶分子机器技术体系，将瓜尔豆胶等原料中的半乳甘露聚糖中的支链半乳糖水解脱支为无支链不同分子量(段)直链甘露聚糖，作为一种β
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1，4糖苷键连接的同多糖，其分子结构和生理功能既有别于葡甘聚糖，又和带支链或脱除部分支链的半乳甘露聚糖有很大的差异，更和多酵母细胞中提取的α
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甘露聚糖有本质上的差异。在部分脱除半乳甘露聚糖中的半乳糖支链的现有文献中,王玲玲等，2009.3.报道的是“使用纤维素酶和普鲁蓝酶降低相对低分子质量胡芦巴半乳甘露聚糖，生成相对低分子质量半乳甘露聚糖，降低其粘度，用于保健食品和功能性食品的研发，以保障人体健康，但因胡芦巴原料较少而无法推广；雷鹏等，2018.7月用瓜尔胶部分去分支，与黄原胶复配增稠，申请了专利：CN108835611A，将半乳糖支链由33％脱支到20％，脱支率为31％。与黄原胶的复配后，作为增稠剂、稳定剂用于食品加工业，由于其脱支率较低，使生理功能受到局限。本专利技术的目的则是要基本脱除半乳甘露聚糖中的半乳糖支链，脱支率≥90％，脱支后无支链的直链甘露聚糖是一种新化合物，主要应用于生物医药领域。
[0015]本专利技术对已基本脱支的不同分子量(段)直链甘露聚糖的得率为60～63％，直链甘露聚糖中的核心产物约占80％。伴生半乳糖的得率为29～30％，换算成脱支率为84～88％。
[0016]该产品既具有极显著增强免疫力，极显著调理胃肠道健康的功能食品的特性，还是抗癌症、抗病毒特医食品先导物的主要成份，更可以作为抗癌症、抗病毒等生物创新药苗头物或先导物的前体物质。同时，本专利技术还伴生出半乳糖，另有其生物学意义。
[0017]本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0018]本专利技术提供了一种酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链甘露聚糖的方法，包括：
[0019]⑴
第1次酶法水解——用超声波声化技术辅助酶解技术——β
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甘露聚糖酶水解轻度降低含半乳甘露聚糖的瓜尔豆胶原料的粘度：
[0020]β
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甘露聚糖酶轻度酶解半乳甘露聚糖，降低其粘度，以利于后续脱支链；
[0021]β
‑
甘露聚糖酶水解位点为β
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1,4糖苷键，在β
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甘露聚糖酶水解过程中，甘本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.酶分子机器技术制备无支链不同分子段直链甘露聚糖的方法，其特征在于：
⑴
第1次酶法水解——用超声波声化技术辅助酶解——β
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甘露聚糖酶轻度降低含半乳甘露聚糖的瓜尔豆胶原料的粘度(瓜尔豆胶半乳甘露聚糖中半乳糖：甘露糖=1：2 )：β
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甘露聚糖酶轻度酶解瓜尔豆胶半乳甘露聚糖，降低其粘度，以利于后续脱支链；β
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甘露聚糖酶水解位点为β
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1,4糖苷键，在β
‑
甘露聚糖酶水解过程中，甘露聚糖主链被切断，导致粘度下降，有利于之后的普鲁兰酶α
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半乳糖苷酶相继水解脱支；
①
为提高酶解效率，参照现有技术，应用超声波的空化作用以辅助后续的酶解过程：
②
将含半乳甘露聚糖的瓜尔豆胶原料按底物浓度 8～12%调浆混匀，用氨水调节pH至8.0～8.5，用超声波装置于25 MHz、强度30%的超声波处理30min；
③
将超声处理过的产物置于真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，离心去除少量的游离氨，调节pH至7.0～7.5，干燥后置室温放置2 h；
④
使用保藏号为 CCTCC No: M 207001芽孢杆菌TQS6发酵产出的高活力中性β
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甘露聚糖酶来轻度酶解含半乳甘露聚糖的原料(总糖80%)，降低其粘度，以利于后续脱支链；
⑤
第1次酶法水解时，底物浓度 8～12%，在500L酶解罐中，按有效容量350kg计，加入超声产物，先用2倍于原料的温水搅拌调浆，然后补足水量，酶底比为1:15～20(v/w)；降解温度 45～50℃，搅拌40～60r/min，pH 6.5～7.5，降解时间：1.5～2 小时，令其粘度稍有降低(降低75～80%，至1 100～1 300 mPa
•
s)时停止酶解转化；
⑥
离心去渣，用薄板换热器升温至130℃，3～5s瞬间灭酶，絮凝去蛋白，过滤机过滤去杂与澄清；此时的粘度为900～1 000 mPa
•
s(粘度低于刚停止酶解时是因为已去杂)；
⑦
采用离子交换装置脱盐，为下工序纳滤的污染防治创造条件；
⑧
前述酶解液称为“轻度酶解的半乳甘露聚糖酶解液原液——亦称半乳甘露次亚聚糖，分子量聚合度范围为80～120kDa”，称为“1＃产物”，瓜尔豆胶原料的转化率为90%；
⑵
第2次酶法水解——用超声波声化技术辅助酶解——市售普鲁蓝酶和α
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半乳糖苷酶按1：0.5的比例联用并先后加入待脱支物中酶法脱除半乳甘露聚糖的半乳糖支链；
①
为提高酶解效率，参照现有技术，应用超声波的空化作用以辅助后续的酶解过程：
②
将“1＃产物”按底物浓度 8～12%调浆混匀，用氨水调节pH至8.0～8.5，用超声波装置于25 MHz、强度30%的超声波处理30min；
③
将超声处理过的产物置于真空离心机，设定温度30℃，1400rpm，离心去除少量的游离氨，调节pH至7.5～8.0，干燥后置室温放置2 h；
④
在500L酶解罐中，按有效容量350kg计，“1＃产物”：水=1:1（w/w），分别加入降解罐中，pH7.0～7.5，酶解罐夹套通入蒸汽或热水把罐内的水预热至 45～50℃；
⑤
待降解水温稳定后，按1＃产物重量的0.2% 加入食品级液体普鲁兰酶液(酶活力1000U～2000U)，随后加入食品级α
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半乳糖苷酶粉剂(酶活力为1000U～2000U)，并不断搅拌，使其混合均匀；
⑥
酶解罐内温度保持在45～50℃ 之间，不断搅拌，酶解1.5～2小时；在酶解过程中采用分光光度法快速测定还原糖(半乳糖)，当检测到酶解脱支溶液中的还原糖含量达到28～30%时，即可停止酶解脱支；
⑦
用薄板换热器升温至130℃，3～5s瞬间灭酶，采用硅藻土过滤机过滤澄清；
⑧
用纳滤装置过滤上述糖液，分离出半乳糖(单糖)，占1＃产物的得率为20～22%，分离
半乳糖后的液体即已基本脱支的直链甘露聚糖，称为“2＃产物”；...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄代勇，黄云琦，卢晓会，刘志格，徐曙光，
申请(专利权)人：深圳绿天琪生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：