本发明专利技术公开了一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别的引物，其包括第一引物对和第二引物对；其中，所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示。本发明专利技术还公开了上述引物的应用，基于该引物的试剂盒以及基于该引物的鉴别方法。实施本发明专利技术，可有效鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的真伪。提物制品和配方颗粒的真伪。提物制品和配方颗粒的真伪。
【技术实现步骤摘要】
一种僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别方法及其应用
[0001]本专利技术涉及中药鉴别
，尤其涉及一种僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别方法及其应用。
技术介绍
[0002]中国药典2020年版规定僵蚕来源为蚕蛾科昆虫家蚕Bombyx mori Linnaeus4～5龄的幼虫感染(或人工接种)白僵菌Beauveria bassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体。其多于春、秋季生产，将感染白僵菌病死的家蚕干燥，得到僵蚕。僵蚕作为常用中药动物药，使用量较大，现市场上出现较多伪品或掺伪品，如绿僵菌感染致死的家蚕、用石灰水染白或白僵菌孢子粉包裹的死蚕、黑死蚕等，它们性状接近，形态相似，依靠传统的鉴别方法难度较大，准确性低，尤其是经过麸炒制成的炮制品、水提取制成标准汤剂，进一步加工成配方颗粒后，在失去药材性状后，更难进行有效的鉴别。为保证僵蚕的药材质量和疗效，急需一种能准确、快速地鉴别僵蚕正品与其伪品的方法。
[0003]目前，中国专利CN106048020A公开了一种动物药材僵蚕的基因身份证，其基于COI和ITS序列的DNA条形码技术，可鉴定家蚕，且基于ITS序列构建邻接(NJ)树以能区分白僵菌与其他致病菌株。由于该方法基于COI和ITS通用引物，PCR产物测序后需对测序结果进行处理和比对，操作步骤繁琐、耗时较长，无法对僵蚕的真伪进行快速检测。另外，中国专利CN107164471A公开了一种快速鉴别中药材僵蚕中白僵菌真伪的分子鉴定方法，其基于白僵菌和多个虫草科物种线粒体全基因，设计白僵菌的特异性引物，通过PCR反应实现对僵蚕中白僵菌真伪的鉴别。但以上方法仅限于僵蚕药材，适用范围较小。目前用于鉴定僵蚕的特异性引物、试剂盒及鉴别方法，其范围主要为药材，而关于僵蚕及其炮制品炒僵蚕的水提取物、配方颗粒的特异性鉴别研究较少。因此，为保障中药配方颗粒用药安全与临床疗效，需要建立准确度高，专属性好的鉴别方法。
技术实现思路
[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于，提供一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别的引物，其可有效鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的真伪。
[0005]本专利技术还要解决的技术问题在于，提供所述僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别的引物的应用。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题在于，提供一种试剂盒，其能够快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的真伪。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题在于，提供一种快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其准确度好、专属性高。
[0008]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提
物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别的引物，其包括第一引物对和第二引物对；
[0009]其中，所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；
[0010]所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示。
[0011]所述第一引物对和第二引物对，其具体序列如下表所示：
[0012][0013]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了所述僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别的引物在(1)、(2)或(3)中的应用：
[0014](1)鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用；
[0015](2)制备用于鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的试剂盒；
[0016](3)构建快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法中的应用。
[0017]在一种实施方式中，鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用为同时鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒是否来源于家蚕和白僵菌。如果僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒同时源于家蚕和白僵菌，则所述僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒为真品；否则为伪劣品。
[0018]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括第一引物对和第二引物对；
[0019]其中，所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；
[0020]所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示。
[0021]在一种实施方式中，所述试剂盒中还包括DNA阳性对照、PCR反应体系、电泳鉴定体系。
[0022]为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，包括以下步骤：
[0023]S1、提取待测样品的基因组DNA；
[0024]S2、以所述基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；
[0025]S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。
[0026]在一种实施方式中，步骤S1中，采用如下方法提取待测样品的基因组DNA：
[0027]取待测样品，加入CTAB沉淀液沉淀提取1～3次；取沉淀物加入CTAB提取液、蛋白酶
K、β
‑
巯基乙醇提取，然后加入氯仿
‑
异戊醇萃取1～3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇
‑
乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待测样品的基因组DNA。
[0028]在一种实施方式中，步骤S2中包括：
[0029]以所述基因组DNA为模板，采用所述第一引物对进行第一PCR扩增，得到第一扩增产物；
[0030]以所述基因组DNA为模板，采用所述第二引物对进行第二PCR扩增，得到第二扩增产物。
[0031]在一种实施方式中，步骤S2中，所述PCR扩增的程序为：将扩增体系在94～96℃的温度下预变性4～6min，然后在预设程序下循环29～40次，最后在71～75℃延伸4～6min；
[0032]其中，所述预设程序为：先在94～96℃的温度下变性20～40s，随后在50～70℃的温度下退火20～40s，再在65～80℃的温度下延伸20～40s。
[0033]在一种实施方式中，所述第一PCR扩增的反应体系为：2
×
M5 Supper FastTaq PCR MasterMix 12.5μL，所述第一引物对的上游引物0.3μL，所述第一引物对的下游引物0.3μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水补足至25μL；
[0034]所述第二PCR扩增的反应体系为：2
×
M5 Supper FastTa本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种用于僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒特异性PCR鉴别的引物，其特征在于，包括第一引物对和第二引物对；其中，所述第一引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：1所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：2所示；所述第二引物对的上游引物的序列如SEQ ID NO：3所示，其下游引物的序列如SEQ ID NO：4所示。2.如权利要求1所述的引物在(1)、(2)或(3)中的应用：(1)鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用；(2)制备用于鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒的试剂盒；(3)构建快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法中的应用。3.根据权利要求2所述的鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的应用，其特征在于，所述应用为鉴定僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒是否来源于家蚕和白僵菌。4.一种试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1所述的引物。5.一种快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、提取待测样品的基因组DNA；S2、以所述基因组DNA为模板，采用如权利要求1所述的引物进行PCR扩增，得到扩增产物；S3、将所述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，以判断待测样品的真伪。6.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片、水提物制品和配方颗粒真伪的鉴定方法，其特征在于，步骤S1中，采用如下方法提取待测样品的基因组DNA：取待测样品，加入CTAB沉淀液沉淀提取1～3次；取沉淀物加入CTAB提取液、蛋白酶K、β
‑
巯基乙醇提取，然后加入氯仿
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异戊醇萃取1～3次；取萃取后上清液，加入异丙醇或异丙醇
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乙酸钠沉淀提取，沉淀物经洗涤、孵育后用水溶解，即得待测样品的基因组DNA。7.如权利要求5所述的快速鉴别僵蚕和/或炒僵蚕及其饮片...
【专利技术属性】
技术研发人员：胡绮萍，钟春琳，谭斯尹，黄上书，刘潇晗，罗宇琴，魏梅，陈向东，
申请(专利权)人：广东一方制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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