用于测量饲料中的蛋白酶活性的方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供了用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的方法和试剂盒。所述方法和试剂盒避免了饲料样品中存在的饲料抑制剂的影响，并且因此提供了一种稳定且准确的用于以高灵敏度测量饲料样品中的蛋白酶活性的方法。量饲料样品中的蛋白酶活性的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于测量饲料中的蛋白酶活性的方法和试剂盒


[0001]本专利技术涉及用于测量饲料中的蛋白酶活性的方法和试剂盒。

技术介绍

[0002]蛋白酶通常被添加到动物饲料中以增加饲料的蛋白质可消化性。在一些情况下，蛋白酶在造粒过程之前加入到饲料中，所述造粒过程涉及将饲料混合物加热到高温。在其他情况下，将蛋白酶喷洒到饲料上和/或混合到饲料中。在任一方式中，往往期望测量饲料产品中蛋白酶活性的量，以确保蛋白酶已经实际上被加入，并且蛋白酶已经以正确的量被加入，并且蛋白酶在造粒和/或混合过程中存活。
[0003]然而，测量饲料中的蛋白酶活性有几个困难。第一，所加入的蛋白酶可能被吸附到饲料的组分中，使所述蛋白酶难以被提取。第二，蛋白酶抑制剂在一些饲料中的存在具有负面影响，并且使得难以准确地鉴定蛋白酶活性。第三，饲料中蛋白酶的包含水平相当低，因此必须建立高度灵敏的方法来测量其中的蛋白酶活性。由于这些困难，现有的方法往往涉及特殊的设备、复杂的工序或专门的知识，或者具有降低的准确度和精确度。
[0004]因此，需要简单、高度灵敏的方法来检测饲料中的蛋白酶活性，所述方法可以容易地进行并且不需要复杂的设备。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的方法。所述方法包括将含有所测量的蛋白酶的饲料提取物与蛋白酶底物一起在含有十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate,SDS)的反应缓冲液中孵育；以及通过检查反应混合物中的颜色变化来测量蛋白酶活性。
[0006]本专利技术还提供了一种用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的试剂盒。所述试剂盒包括用于制备饲料提取物的提取液、蛋白酶底物、和含有SDS的反应缓冲液。在定量测量的实施方式中，根据本专利技术的试剂盒进一步包括一种或多种标准酶溶液。
附图说明
[0007]图1是显示含有150,000U/Kg蛋白酶的试管(左试管)与不含蛋白酶的试管(右试管)之间的颜色变化差异的照片；
[0008]图2是显示用反应缓冲液中不同浓度的SDS进行的蛋白酶活性测定的结果的坐标图；
[0009]图3是通过使用蛋白酶ProAct360的参考标准溶液制备的标准曲线；
[0010]图4是显示对蛋白酶ProAct进行的蛋白酶活性测定的结果的坐标图；
[0011]图5是显示对蛋白酶AxtraPro进行的蛋白酶活性测定的结果的坐标图；和
[0012]图6是显示对用或不用SDS提取的饲料中的蛋白酶进行的蛋白酶活性测定的结果的坐标图。
具体实施方式
[0013]本专利技术提供了一种用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的方法，所述方法包括以下步骤：
[0014]a)用提取液提取饲料样品以获得饲料提取物；
[0015]b)将饲料提取物的等分试样与蛋白酶底物和反应缓冲液混合以形成反应混合物，其中所述蛋白酶底物是与发色团偶联的多肽，并且所述反应缓冲液包含十二烷基硫酸钠(SDS)；
[0016]c)在使发色团从蛋白酶底物中释放出来并导致反应混合物颜色变化的条件下孵育所述反应混合物；和
[0017]d)通过检查所述反应混合物的颜色变化来测量蛋白酶活性。
[0018]在本专利技术中，术语“饲料样品”可以用“饲料”、“食物”、“预混物”或“食物样品”代替，并且是指任何含有待测量的蛋白酶的样品。根据本专利技术的饲料样品可以包含动物饲料的一种或多种成分。动物饲料成分的非限制性示例包括：玉米或玉米成分，例如玉米粉、玉米纤维、玉米皮、玉米DDGS(含有可溶固形物的干酒糟(distiller's dried grain with solubles))、青贮饲料、磨碎的玉米、玉米胚芽、玉米麸质、玉米油和玉米植株的任何其它部分；大豆或大豆成分，例如大豆油、大豆豆粕、大豆皮、大豆青贮饲料、磨碎的大豆和大豆植株的任何其它部分；小麦或小麦的任何成分，例如小麦粗粉、小麦纤维、小麦壳、小麦谷壳、磨碎的小麦、小麦胚芽和小麦植株的任何其它部分；大麦或大麦植株的成分；甘油；卵磷脂；瘤胃保护脂肪；糖蜜；草类，例如果园草和羊茅草；鱼粉、肉骨粉；羽毛粉；和家禽副产品粉；和用于青贮饲料或干草的苜蓿和/或三叶草，以及本文所述的任何饲料成分的各种组合，或本领域中通常已知的其它饲料成分。如本领域中将认识到的，饲料组合物可以进一步补充有氨基酸、维生素、矿物质和其它饲料添加剂，例如其它类型的酶、有机酸、精油、益生菌、益生元、抗氧化剂、色素、抗结块剂等。
[0019]根据本专利技术，饲料样品可以是动物饲料领域中已知的任何合适的形式，并且可以是湿的或干的组分。例如，饲料样品可以是选自由以下组成的组的形式：全价饲料、饲料补充剂、饲料添加剂、预混物、撒饲料(top
‑
dress)、桶装饲料(tub)、矿物质、粗粉、块、粒料、糊状饲料(mash)、液体补充剂、灌服剂(drench)、丸剂(bolus)、零食(treat)以及它们的任何组合。此外，饲料样品在用根据本专利技术的提取液提取之前可以任选地进行研磨。
[0020]本专利技术的饲料可被配制用于施用于任何动物。动物包括但不限于人类、食用动物如家禽(例如，鸡，包括肉鸡、蛋鸡和种鸡、鸭、小母鸡(game hen)、鹅、珍珠鸡/母鸡、鹌鹑、和火鸡)、肉牛、奶牛、小牛、猪、山羊、绵羊、野牛、和鱼；伴侣动物，例如猫、狗、马、兔、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和豚鼠)、刺猬和雪貂；研究用动物，例如啮齿动物、猫、狗、兔子、猪、和非人灵长类动物；以及动物园动物，例如非人灵长类动物、狮子、老虎、熊、大象、长颈鹿等。
[0021]本专利技术的饲料样品可以包含蛋白酶以提高饲料的可消化性，所述蛋白酶可以通过本专利技术的方法来测量。饲料样品中所用的蛋白酶可以是本领域中通常已知的任何蛋白酶。蛋白酶的示例包括但不限于天冬氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶以及它们的组合。优选地，蛋白酶是丝氨酸蛋白酶。更优选地，蛋白酶是蛋白酶ProAct360(DSM Nutritional Products Ltd.,
Switzerland)和/或ProAct(DSM Nutritional Products Ltd.,Switzerland)和/或AxtraPro(Dupont,USA)。
[0022]在根据本专利技术的方法中，首先在步骤a)中用提取液对饲料样品进行提取。
[0023]所述提取液可以是任何适于从饲料样品中提取蛋白酶的溶液。提取液的一个示例是缓冲溶液。所述缓冲溶液可以是任何含有以下缓冲试剂中的一种或多种缓冲试剂的缓冲溶液：H2O、氯化钠(NaCl)、甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸(HEPES)和三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。提取液可以含有或可以不含有磷酸盐。优选地，提取液不含磷酸盐。更优选地，提取液是蒸馏水中的NaCl溶液。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于测量饲料样品中的蛋白酶活性的方法，所述方法包括以下步骤：a)用提取液提取所述饲料样品以获得饲料提取物；b)将所述饲料提取物的等分试样与蛋白酶底物和反应缓冲液混合以形成反应混合物，其中所述蛋白酶底物是与发色团偶联的多肽，并且所述反应缓冲液包含十二烷基硫酸钠(SDS)；c)在使所述发色团从所述蛋白酶底物中释放出来并导致所述反应混合物颜色变化的条件下孵育所述反应混合物；和d)通过检查所述反应混合物的所述颜色变化来测量所述蛋白酶活性。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述饲料是用于动物的任何形式的饲料，所述动物包括但不限于人类、食用动物如家禽(例如，鸡，包括肉鸡、蛋鸡和种鸡、鸭、小母鸡、鹅、珍珠鸡/母鸡、鹌鹑和火鸡)、肉牛、奶牛、小牛、猪、山羊、绵羊、野牛和鱼；伴侣动物，例如猫、狗、马、兔、啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、仓鼠、沙鼠和豚鼠)、刺猬和雪貂；研究用动物，例如啮齿动物、猫、狗、兔子、猪和非人灵长类动物；以及动物园动物，例如非人灵长类动物、狮子、老虎、熊、大象、长颈鹿等。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白酶是选自由以下组成的组的任何一者或多者：天冬氨酸蛋白酶、天冬酰胺蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、谷氨酸蛋白酶、金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶和苏氨酸蛋白酶，并且优选地所述蛋白酶是蛋白酶ProAct和/或ProAct360和/或AxtraPro。4.根据权利要求1
‑
3中任一项所述的方法，其中所述提取液是含有选自由以下组成的组的缓冲试剂中的一者或多者的缓冲溶液：H2O、氯化钠(NaCl)、甘氨酸、磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、4
‑
(2
‑
羟乙基)
‑1‑
哌嗪乙磺酸(HEPES)、三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)。5.根据权利要求1
‑
4中任一项所述的方法，其中所述提取液包含聚山梨醇酯表面活性剂，例如20、40、60或80。6.根据权利要求1
‑
5中任一项所述的方法，其中所述提取液含有1mM至500mM，优选地20nM至800mM，更优选地50mM至500mM，例如55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、250mM、300mM、350mM、400mM和450mM的氯化钠，以及0.001w/v％至0.1w/v％，优选地0.005w/v％至0.05w/v％，例如0.006w/v％、0.007w/v％、0.008w/v％、0.009w/v％、0.01w/v％、0.011w/v％、0.012w/v％、0.013w/v％、0.014w/v％、0.015w/v％、0.016w/v％、0.017w/v％、0.018w/v％、0.019w/v％、0.02w/v％、0.025w/v％、0.03w/v％、0.035w/v％、0.04w/v％或0.045w/v％的20。7.根据权利要求1
‑
6中任一项所述的方法，其中所述蛋白酶底物选自由以下组成的组：N
‑
琥珀酰
‑
Ala
‑
Ala
‑
Pro
‑
Phe
‑
pNA、N
‑
琥珀酰
‑
Ala
‑
Ala
‑
Pro
‑
Leu
‑
pNA、N
‑
琥珀酰
‑
Ala
‑
Ala
‑
Pro
‑
Arg
‑
pNA、N
‑
甲基磺酰基
‑
D
‑
Phe
‑
Gly
‑
Arg
...

【专利技术属性】
技术研发人员：克莱尔，
申请(专利权)人：诺维信专利公司，
类型：发明
国别省市：